Диссертация (1145733), страница 16
Текст из файла (страница 16)
incertae sedis, т.е. к таксонам снеясным систематическим положением. Клон R6-2, показал отдаленное родство (83 %сходством) с D. hypogeium. Отдел Viridiplantae, представленный клоном R6-20, был сходен на 88% с хпДНК P. minor. Клоны 3R-7 и R6-2 были уникальны для данной библиотеки, так как они не60были выявлены ни в одной другой даже в минорных количествах.
Таким образом, клоны 3R-7,R6-2 и R6-20 были отнесены нами к неидентифицированным филотипам.Филогенетический анализ библиотеки 37R/31R позволил выявить 5 бактериальных филумов:Actinobacteria (3 филотипа), Bacteroidetes (4), Planctomycetes (3), Proteobacteria (2),Verrucomicrobia (1) и 3 эукариотных отдела: мтДНК Xanthophyta (1) и хпДНК Dictyochophyceae(1) (оба Stramenopiles), хпДНК Viridiplantae (2). К доминирующим были отнесены все филотипыфилума Actinobacteria (клоны 37R-2, 37R-26, 37R-31), составившие около 34 % от общего числаклонов; филотипы 31R-1 и 31R-2 филума Bacteroidetes, 2 клона (37R-7 и 37R-15) изProteobacteria,одинпредставитель(клон37R-35)изфилумаPlanctomycetes.Всеэукариотические доминантные отделы были представлены по одному филотипу: Viridiplantae(клон 31R-8), Dictyochophyceae (клон 37R-21), мтДНК Stramenopiles (клон 37R-39).Клоны 37R-2 и 37R-31 принадлежавшие к acI-AVI и acI-AIV кладу acI линии (Warnecke et al.,2004) пресноводных Actinobacteria были сходны на ~ 97 % с “Candidatus” P.
limnetica (Jezbera etal.). Клон 37R-26 был идентичен на 98,8 % с M. pyrenivorans. Филотипы 31R-1 и 31R-2 былиблизкородственны на 99 % с Sediminibacterium salmoneum и на 95,4 % с C. sancti, соответственно.Филотипы 37R-15 и 37R-7 показали близкородственное сходство на уровне 97,3 % с R.frigidaquae и на уровне 94,1 % с Rhodovarius lipocyclicus, соответственно. Филотип 37R-35показал отдаленное родство (85 %) с Algisphaera agarilytica и, тем самым, был отнесен нами кнеидентифицированным. Филотип 31R-8 оказался на 99,6 % идентичным зеленой водорослиMychonastes huancayensi. Отметим, что два последних филотипа были уникальны для даннойбиблиотеки, т.е. они не были обнаружены ни в одной другой библиотеке даже в минорныхколичествах.
Кроме филотипа 37R-35 к неидентифицированным был отнесен также филотип37R-39 показавший 74 % сходства с мтДНК страменомила N. oceanica.Согласно проведенному нуклеотидному анализу в библиотеке f3R было выявлено 4бактериальных филума: Bacteroidetes (3 филотип), Proteobacteria (α (2) и β (1)), Planctomycetes(2), Actinobacteria (1) и 2 эукариотических отдела: Viridiplantae (1) и Dictyochophyceae (1). Средибактерий доминировал только 1 филотип (клон f3R-35) филума Bacteroidetes, тогда как вэукариотических – оба филотипа. Причем, если филотип f3R-8 отдаленно родственный (93,5 %)хпДНК M.
arctica из Dictyochophyceae составил в библиотеке 10 % от общего числа клонов, тофилотип f3R-22 родственный на 88 % хпДНК P. minor из Viridiplantae – 54 % от всей выборки.Таким образом, филотип f3R-22 был отнесен к неидентифицированным. Филотип f3R-35 показалвысокое сходства на уровне 99 % с S. salmoneum из филума Bacteroidetes.Сравнение трех библиотек показало, что в f3R (ПГ) было найдено только три доминантныхфилотипа, тогда как в R367A+B (v3-v5) и 37R/31R (v4-v8) - 8 и 11 таких филотипов,соответственно. В результате этого даже на уровне филумов и отделов все библиотеки61существенно различались.
Так, в библиотеке R367A+B подавляющее большинство (70 % отобщего числа клонов) составили представители филума Actinobacteria (в том числе группафилотипов, близкородственных “Candidatus” P. limnetica), тогда как в библиотеке f3R преобладал(54 %) один представитель отдела Viridiplantae. Отметим, что значительную долю (26 %) вданнойбиблиотекесоставилиминорныефилотипы.Библиотека37R/31Rоказалась«выравненной» по составу – 34 % филотипов из Actinobacteria и по 14 % филумы Bacteroidetes(2 доминантных филотипа: S. salmoneum и C.
sancti (95,4 %)) и Planctomycetes (3неидентифицированных филотипа). Общих доминантных филотипов для трех библиотеквыявлено не было. Для R367A+B и 37R/31R общими оказались 3 доминантных филотипа,близкородственные “Candidatus” P. limnetica, M. pyrenivorans и R. frigidaquae. Для библиотек37R/31R и f3R – S. salmoneum и M. arctica, а для R367A+B и f3R – P. minor. В библиотекахR367A+B и 37R/31R было выявлено по 2 уникальных (выявленных только в этих библиотеках)доминантных филотипа. В первой, неидентифицированный филотип, отдаленно родственный (83%) Desulfomicrobium hypogeium (δ-proteobacteria), а также неизвестный представитель Candidatedivision OD1. Во-второй, неидентифицированный филотип, родственный (85 %) Algisphaeraagarilytica (Planctomycetes) и филотип, родственный (99,6 %) гДНК зеленой водоросли M.huancayensi.Всего во всех трех библиотеках было обнаружено 12 неидентифицированных филотипов: 11уникальных (R367A+B – 4, 37R/31R – 5, f3R – 2) и один общий для всех трех библиотек.
Так вбиблиотеке R367A+B было выявлено три доминантных (3R-7, R6-2 и R6-20) и два минорных (R646 и 3R-33) филотипа, тогда как библиотека 37R/31R содержала два доминантных (37R-35 и 37R39) и четыре минорных (31R-6, 37R-12, 37R-36, 37R-6) филотипа. В библиотеке f3R былообнаружено один доминантный (f3R-22) и два минорных (f3R-3 и f3R-5) неидентифицированныхфилотипа.
Кроме того, в двух библиотеках (f3R и 37R/31R) было выявлено по одному минорномуHA-филотипу. В обоих случаях был отмечен высокий процент сходства на уровне 99,8 % дляклона 37R-3 и 98,7 % для клона f3R-36 с филотипами, являющимися частью микробиома кожичеловека (Gao et al., 2007; Kong et al., 2012).Судя по анализу статистических данных наименьшей степенью покрытия (85 %) обладалабиблиотека f3R, что также подтверждается уровнем наклона аналитической кривой (табл. 5, рис.12). Показатели значения индекса Чао 1 для 37R/31R и R367A+B составили 22,5 и 19,5соответственно.
Интересно, что показатели значения индекса Чао 1 были практически идентичныдля всех библиотек, подтверждая тот факт, что выборка библиотеки f3R была недобрана. Так,при значении показателя индекса Чао 1 равным 19 число выявленных филотипов в библиотекебыло 12, среди которых 7 были представлены единичными находками. Наибольшее62биоразнообразие среди всех созданных (всего 14) библиотек показала библиотека 37R/31R(индекс Шэннона-Уивера - 2,7).3.7 Сравнительный анализ микробного разнообразия 4-х горизонтов озера сиспользованием двух различных областей гена 16S рРНК3.7.1 Сравнение микробного разнообразия 4-х горизонтов по области v3-v5 гена 16SрРНКВ результате секвенирования 4-х библиотек (горизонты 1,3 м, 100 м, 200 м и 367 м), созданныхпо области v3-v5 генов 16S рРНК наибольшее биоразнообразие на уровне филумов и отделовбыло выявлено в 100 метровом горизонте (6), тогда как наименьшее (4) в 200 метровом горизонте(рис.
9). Причем, по числу филотипов (15) горизонт 367 м в два раза превышал остальные. Вкаждом из горизонтов были выявлены филотипы из филума Actinobacteria, составлявшие от 50до 70 % клонов в каждой библиотеке. Причем, подавляющее большинство (от 42 до 55 %) этихфилотипов принадлежало к acI-AVI кладу, acI-AIV кладу и неопределенному кладу acI линиипресноводных Actinobacteria сходных на ~ 97 % с “Candidatus” P.
limnetica. Также во всехгоризонтах встречалась ОТЕ близко родственная M. pyrenivorans. Помимо представителейфилума Actinobacteria, во всех горизонтах были также выявлены ОТЕ филума Verrucomicrobia,представленные, правда, только в минорных количествах. Во всех горизонтах также былавыявлена последовательность, принадлежащая разделу Viridiplantae, отдаленно родственная (88%) хпДНК P. minor и хорошо представленная в двух верхних горизонтах. Что можно объяснитьдостаточным количеством солнечной радиации, по сравнению с нижними горизонтами,достигающей данных глубин. Только филум Bacteroidetes и класс δ-proteobacteria былиобнаружены в каком-то одном из горизонтов.
Первый – в верхнем, а второй – в нижнемгоризонте. Оба были представлены одним доминантным филотипом.Согласно индексу Гуда, все выборки для 4-х библиотек были достаточно репрезентативны спокрытием ≥92 %. Для библиотек R1B (1,3 м) и R200B (200 м) высокая степень достаточностивыборок подтверждается также выходом аналитических кривых на плато (рис.12). Судя поиндексу видового богатства Чао1 биоразнообразие библиотеки R367B (горизонт 367 м)потенциально в 2,5 – 3 раза выше, чем у остальных (табл.5).63100%90%δ-proteobacteria80%Verrucomicrobia70%Candidate division OD160%хпДНК Dictyochophyceae50%Bacteroidetes40%хпДНК Viridiplantae30%α-proteobacteria20%Actinobacteria10%0%1,3 м100 м200 м367 мРисунок 9.
Микробное разнообразие 4-х горизонтов водного столба, выявленное по областиv3-v53.7.2 Сравнение микробного разнообразия 4-х горизонтов по области v4-v8 гена 16SрРНКСравнительный анализ микробного разнообразия 4-х горизонтов водного столба, выявленногопо области v4-v8 генов 16S рРНК, показал, что наибольшее разнообразие на уровне филумов иотделов было нижнем (8) горизонтах (рис. 10). На уровне филотипов наибольшее с двух кратнымпревосходством разнообразие (18 ОТЕ) показал нижний водный слой. Почти все клоновыебиблиотеки показали достаточно высокую степень выравненности. Только в библиотеке 2R(горизонт 200 м) филум Actinobacteria численно составлял около 60 % от всей выборки.
Востальных же случаях доминирование какой-либо филогенетической группы составляло, какнапример филум Planctomycetes в библиотеке R1B (1,3 м), не более 40 %. Только три филумабыли выявлены во всех 4-х горизонтах: Actinobacteria, Planctomycetes и Proteobacteriaсоставившие в сумме от 38 до 95 % клонов в каждой библиотеке. Из всех филотипов лишьпоследовательность сходная на 98,8 % с M. pyrenivorans встречалась по всему профилю водногостолба.
Отметим, что класс β-proteobacteria был обнаружен только в верхнем горизонте и былпредставлен уникальной именно для этого водного слоя бактерией (99,1 % сходства) L.planktonicus, тогда как такие филумы как Bacteroidetes и Verrucomicrobia были обнаруженытолько в нижнем. Филум Bacteroidetes объединил в себе 2 доминантных и 2 минорных филотипа,последние были уникальны для данного горизонта. Филум Verrucomicrobia был представлентакже уникальным минорным филотипом. Интересно, что 3 из 6 представителей, один изкоторых доминантный, филума Planctomycetes были также выявлены только в нижнем горизонте.64Довольнонеожиданнымбылообнаружениевэтомжегоризонтедоминантнойпоследовательности, показавшей 99,6 % сходства по 18S рРНК с зеленой водорослю M.huancayensi.
Таким образом, праймеры на бактериальную область v4-v8 генов 16S рРНКоказались комплиментарны участку рДНК ядерного генома эукариот. В общем, из 18 филотипов7 были уникальны именно для придонного горизонта.Статистическая оценка достаточности размера выборок показала, что только библиотека 17R(1,3 м) была репрезентативна, тогда как выборка библиотеки 37R близка к насыщению (табл.5).Что касается двух оставшихся, то они обе показали менее 90 % покрытия согласно индексу Гуда,а библиотека R2007 к тому же и самое низкое значение (~ 81 %) среди всех созданных библиотек.Тем самым выборки двух внутренних горизонтов оказались недостаточно репрезентативны, чтотакже подтверждается наклоном аналитических кривых (рис.12).100%90%Verrucomicrobia80%Bacteroidetes70%мтДНК60%хпДНК Viridiplantae50%хпДНК Dictyochophyceae40%Planctomycetes30%β-proteobacteria20%α-proteobacteria10%Actinobacteria0%1,3 м100 м200 м367 мРисунок 10.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
