Диссертация (1145733), страница 18
Текст из файла (страница 18)
Данныетаксономические группы внесли незначительный вклад в общую долю клонов.69Таблица 6. Распределение доминантных филотипов по 4-м горизонтам водного столба и суммарно по двум областям генов 16S рРНК(v3-v5 и v4-v8)Ближайший таксон в GenBank0R-2 (JF901736) Planktophila sp0R-16 (JF901737) Planktophila spR6-16 (JF901738) Planktophila sp17R-1 (JF901739) Mycobacterium pyrenivoransR6-8 (JF901740) (Acidimicrobiaceae)R367В/33**Arthrobacter agilisR367В/35**Microbactetium phyllosphaeraeR6-18 (JF901741) Roseomonas sp37R-7 (JF901742) (Acetobacteraceae)R2007-5 Mesorhizobium lotiR13В/21**Brevundimonas intermediaR100В/2**Methylobacterium marchantiaeR367В/1А**Brevundimonas vesicularisR367В/3А**Pseudomonas azotoformansR367В/34-9**Acinetobacter oleivoransR367В/34-12**Acinetobacter calcoaceticus17R-29 (JF901743) Limnohabitans planktonicusR6-2 (JF901744)Ближайший вид в GenBankПрокариотыActinobacteriaCandidatus Planktophila limnetica (FJ428831)acI-AVI cladeacI-AIV cladeНеидентифицированный клад асI линииMycobacterium pyrenivorans (NR 028970)Ilumatobacter fluminis (NR_041633)Arthrobacter agilis (AJ577725)Microbactetium phyllosphaerae (NR_025405)α-proteobacteriaRoseomonas frigidaquae (NR_044455.1)Rhodovarius lipocyclicus (NR_025629)Mesorhizobium loti (NR_074162)Brevundimonas intermedia (NR_041966)Methylobacterium marchantiae (AB698714)Brevundimonas vesicularis (FM955876)γ- proteobacteriaPseudomonas azotoformans (JF792088)Acinetobacter oleivorans (NR_102814)Acinetobacter calcoaceticus (NR_117619)β-proteobacteriaLimnohabitans planktonicus (FM165535)δ-proteobacteriaDesulfomicrobium hypogeium (AF132738)BacteroidetesСходство,%96,596,296,898,893,999,699,497,394,198,099,799,9100Горизонты (м)1,3100200367111(8)7(5)31(20)19(13)6(4)16(8)8(4)12(6)22(11)8(4)20(27)3(4)15(20)14(19)3(4)++4(6)4(5)6(3)+++10098,999,599,183*+++7(5)2(3)700R-11 (JF901745) Chitinophaga spf3R-35 (JF901746) Sediminibacterium salmoneum95,499,04(3)17R-18 (JF901747)Chitinophaga sancti (AB078068)Sediminibacterium salmoneum (NR_044197)PlanctomycetesBlastopirellula marina (NR_029226)88*13(9)17R-2 (JF901748) (Planctomycetaceae)Singulisphaera rosea (FN391026)94,66(4)17R-13 (JF901749)37R-35 (JF901750)Schlesneria paludicola (NR_042466.1)Algisphaera agarilytica (AB845176)Candidate division OD1Uncult.
bact. (AY922093)ЭукариотыViridiplantae, зеленые водорослиPedinomonas minor (FJ968740) хпДНКMychonastes huancayensi (GQ477050) 18S рРНКStramenopilesXanthophyta, жёлто-зелёные водоросли (мтДНК)Nannochloropsis oceanica (KC568462)Nannochloropsis limnetica (KC568459)Dictyochophyceae (хпДНК)Mesopedinella arctica (AY702158)90*4(3)3R-7 (JF901751)0R-1 (JF901753) Pedinophyceae (класс)31R-8 Mychonastes huancayensi37R-39 (JF901754)17R-9 (JF901755) Nannochloropsis limneticaf3R-8 (JF901752) Pedinellales (порядок)* - неидентифицированный филотип (менее 90 % сходства).** - культуры, полученные в работе.1-процент клонов в библиотеке.В скобках – число клонов.Серым фоном выделены общие филотипы минимум для двух горизонтов.4(5)3(4)85*3(4)90,9*4(5)88*99,674*99,993,59(6)18(9)4(3)12(8)4(5)2(3)2(3)18(9)6(3)2(3)71минорные100%90%мтДНК80%хпДНК Viridiplantae70%хпДНК Dictyochophyceae60%Candidate division OD1Planctomycetes50%Bacteroidetes40%δ-proteobacteria30%β-proteobacteria20%α-proteobacteria10%Actinobacteria0%v3-v5v4-v8ПГРисунок 13.
Сравнение 3-х областей (v3-v5/v4-v8/16S) генов 16S рРНК на примеремикробного разнообразия, выявленного из верхнего и нижнего горизонта водного столбаозераОбщими для всех областей были только филум Bacteroidetes и отдел Viridiplantae, тогда какобщих филотипов выявлено не было. По области v3-v5 и v4-v8 было выявлено 3 и 4 доминантныхнеидентифицированных филотипа соответственно. Доля минорных филотипов по областям v3v5 и v4-v8 не превышала 9 %, тогда как по полноразмерному гену, доля таких филотиповсоставила 18 %.Таким образом, праймерная система на полноразмерный ген оказалась менее универсальнойпо сравнению с v3-v5 и v4-v8 участками гена 16S рРНК, что выразилось в крайне низкомразнообразии на уровне филумов, а также выраженной «специфичностью» к филотипу иззеленых водорослей.Из всего выше сказанного следует, что использование только двух областей (v3-v5 и v4-v8)гена 16S рРНК, позволило достаточно полно вскрыть и охарактеризовать состав и структурумикробного разнообразия водного столба озера Радок.3.9 Молекулярно-биологический анализ дополнительного образца (исток рекиМежозерная (глубина 2 м)) по двум (v3-v5 и v4-v8) областям гена 16S рРНКПервоначальные размеры выборок для обеих библиотек составили для R2r – 38 клонов, а дляR2r2 – 24 клона.
В обеих выборках были обнаружены филотипы-контаминанты: в R2r – 4 таких72филотипа, тогда как в R2r2 – 3 филотипа. В итоге окончательный размер двух выборок составил24 клона (6 филотипов) для R2r и 20 клонов (6 филотипов) для R2r2 (рис. 14).Библиотека R2r (v3-v5) была представлена 4-мя бактериальными филотипами, относящимся кфилумам Actinobacteria и Proteobacteria (α и β), а также 2-мя эукариотическими филотипами,представленными хпДНК Viridiplantae и Chrysophyceae.
Из них доминантными были только 4филотипа. Это 2 клона R2r-19 и R2r-31, относящиеся, первый к acI-AIV кладу, второй к acI-AVIкладу acI линии пресноводных Actinobacteria, показавшие 96,2 и 96,5 % сходства с “Candidatus”P. Limnetica, филотип, близкородственный (97,3 % сходства) R. frigidaquae из класса βproteobacteria и филотип, показавший далекое родство (88 %) с хпДНК P. minor (Viridiplantae).Библиотека R2r2 (v4-v8) была представлена 5 бактериальными (из Actinobacteria,Planctomycetes, α-proteobacteria и Candidate division OD1) и 1 эукариотическим филотипом(Chrysophyceae). Из них только два были доминантными – один, близкородственный (98,8 %) M.pyrenivorans (Actinobacteria), а другой – родственный (93 %) хпДНК золотистой водорослиOchromonas distigma (Chrysophyceae, Stramenopiles).R2r-1941%R2r-1513%35%ActinobacteriaR2r2-2445%β-proteobacteriaViridiplantaeR2r-36R2r-3125%ChrysophyceaeR2r2-320%минорныеРисунок 14. Сравнение микробного разнообразия 2-х библиотек, созданных по области v3v5 и v4-v8 генов 16S рРНК и полученных путем отбора пробы из истока реки Межозерная(глубина 2 м).Униальный филотип R2r2-5, более нигде не выявленный, оказался родственным (95 %)“Candidatus” Nostocoida acidiphila из Planctomycetes.Отметим, что из 6 филотипов найденных вобеих библиотеках, 3 оказались общими: это филотипы, родственные “Candidatus” P.
limnetica иR. frigidaquae, а также водоросли O. distigma, обнаруженной только в этом водном образце.Статистическая оценка достаточности размера выборок показала, что обе библиотеки былирепрезентативны, что подтверждается индексом Гуда и наклоном аналитических кривых (рис. 5,табл. 12). Индексы Чао1 и Шенонна-Уивера показали сходные между библиотеками значения.Между тем индекс Чао1 был наименьшим среди индексов, полученных для других глубинводного столба озера.733.10 Культивирование бактерий филума Planctomycetes из 4-х горизонтов водногостолба озераВ результате проведенного культивирования было получено 12 изолятов бактерий: 4 изолята– верхний горизонт, 1 - 100 м, 1 - 200 м и 6 – нижний придонный горизонт.
Наибольшее числокультур было получено из нижнего и верхнего горизонтов, что совпадает с разнообразием,выявленным с использованием молекулярных методов.После риботипирования ампликонов полноразмерных генов 16S рРНК оказалось, что 3изолята совпали по рестрикционным профилям с другими тремя изолятами, на основании чегоони были объединены.
Кроме того, были выявлены 2 гетерогенных (по рестрикционнымпрофилям) изолята, которые в дальнейшем были разделены на две популяции клонов каждыйпутем клонирования.В итоге, 11 изолятов были клонированы и идентифицированы по полной последовательностигенов 16S рРНК. При анализе полученных последовательностей 2 изолята были отнесены кконтаминантам (присутствие в БК), а 2 изолята оказались одного филотипа (более 98 %сходства).Оставшиеся 8 филотипов были идентифицированы на уровне вида и отнесены к двум филумамбактерий: Actinobacteria (2 филотипа) и Proteobacteria (6 филотипов) (Табл.
6). Изактинобактерий оба филотипа (Arthrobacter agilis, Microbactetium phyllosphaerae) были выявленыв нижнем горизонте. Там же были выявлены все 3 филотипа γ-протеобактерий (Acinetobacteroleivorans, Acinetobacter calcoaceticus, Pseudomonas azotoformans), тогда как α-протеобактерии(Brevundimonas intermedia, Brevundimonas vesicularis, Methylobacterium marchantiae) былираспределены фактически равномерно по всему водному столбу. Отметим, что ни один из 8«культивируемых» филотипов не совпал с 16S рДНК филотипами, выявленными в даннойработе.
Кроме того, среди доминантных филотипов, выявленных ранее по полноразмерному гену16S рРНК в верхнем и нижнем горизонтах водного столба озера Радок (Karlov et al., 2011), данныекультивируемые филотипы также отсутствовали. Помимо этого, тот факт, что все они былиоднозначно идентифицированы, говорит об ограниченности метода культивирования в изучениимикробного разнообразия.Вместе с тем, на примере трех пресноводных озер (Земля Виктории, Вост. Антарктида)показано (Michaud et al., 2012), что бактериальные изоляты и филотипы, выявленные методомсеквенирования по Сэнджеру, могут частично перекрываться на уровне рода. Более того, какпоказано (Huang et al., 2013), проводивших исследования на пресноводном озере Тавани (оазисШирмахера, Вост. Антарктида), из 15 родов различных разделов бактерий, полученных методомкультивирования, 14 были выявлены также методом секвенирования по Сенджеру.74Таким образом, использованные условия культивирования оказались не пригодны длявыявления бактерий филума Planctomycetes.3.11 Филогенетический анализ доминантных некультивируемых и культивируемыхбактериальных филотиповБыл выполнен филогенетический анализ всех описанных выше доминантных филотиповбактерий.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
