Диссертация (1145733), страница 14
Текст из файла (страница 14)
Анализ всех трех библиотек на наличие контаминантов путем сравнения с БК выявил 4 такихфилотипа в библиотеке R1B и 1 филотип в 17R, тогда как в библиотеке f1R такихпоследовательностей не обнаружено. Отметим, что 2 филотипа-контаминанта из библиотекиR1B были представлены тремя и двумя клонами, соответственно, что существенно повлияло наразмер выборки, который в окончательном варианте составил 31 клон и 9 филотипов (покрытие94 %).
Размер выборки для библиотеки f1R составил 39 клонов и 6 филотипов (покрытие 92 %),а для библиотеки 17R - 39 клонов и 9 филотипов с покрытием в 97 % (Табл. 5).Филогенетический анализ библиотеки R1B позволил отнести филотипы к 4 филумамбактерий: Actinobacteria (3 филотипа), Proteobacteria (2), Verrucomicrobia (2), Bacteroidetes (1), атакже к одному виду зелёных водорослей (хпДНК, Viridiplantae). Из них доминировали 5филотипов, относящиеся к двум филумам бактерий и одному виду зелёных водорослей:Actinobacteria (3 филотипа – 54 % от общего количества клонов), Bacteroidetes (1 филотип – 10%) и хпДНК зелёной водоросли (1 филотип – 20 %). Отметим, что все 9 филотипов имели 98 %и более сходства с ближайшей последовательностью в GenBank.Последовательности–представителидоминантныхклонов0R-2(наиболеепредставительный – 27 % от всей библиотеки) и 0R-16, относящиеся к acI-АVI и acI-AIV кладам(Newton et al., 2007) были сходны на 96,5 % и 96,2 % с “Candidatus” P.
limnetica, обнаруженной впресноводном озере Эгель в Австрии (Jezbera et al., 2009). Филотип 0R-37 показал 98,8 %сходства с M. pyrenivorans. Филотип 0R-11 (Bacteroidetes) показал наибольшее сходство (95,4 %)с Chitinophaga sancti, а филотип 0R-1 (Viridiplantae, Chlorophyta) – 88 % с хпДНК Pedinomonasminor и, тем самым, был отнесен к неидентифицированным.Идентификационный анализ библиотеки f1R позволил отнести 6 выявленных филотипов к 3филумам бактерий: Proteobacteria (1) и Bacteroidetes (1), Verrucomicrobia (1), а также к двумвидам страменопилов (мтДНК Xanthophyta и хпДНК Dictyochophyceae) и к одному виду зелёныхводорослей (хпДНК). Из них доминировал только филотип хпДНК зелёной водоросли(Viridiplantae), составивший 84 % от общего количества клонов.Доминантный филотип f1R-4 (Viridiplantae) показал 84 % сходства с хпДНК зелёнойводоросли Pedinomonas minor, и, тем самым, оказался неидентифицированным.
К нему же былотнесен один минорный филотип, связанный с мтДНК Nannochloropsis oceanica. Только один52филотип f1R-5 (1 клон) был отнесён к HA-филотипам. Покрытие библиотеки f1R в конечномитоге составило 95 %.16%13%17%17R-9*8%0R-226%17R-125%17R-13*8%0R-1617%0R-1*20%17R-2913%17-1823%0R-1110%17R-210%0R-3710%ActinobacteriaхпДНК ViridiplantaeBacteroidetesмтДНКβ-proteobacteriaминорныеf1R-4*84%PlanctomycetesРисунок 5.
Сравнение доминантных филотипов библиотек R1B, 17R и f1R, выявленных вверхнем горизонте оз. Радок, по результатам анализа v3-v5, v4-v8 и полноразмернойбиблиотек. Звездочкой обозначены неидентифицированные филотипы.Анализ библиотеки 17R выявил 9 филотипов, относящихся к 3 бактериальным филумам:Planctomycetes (3 филотипа), Actinobacteria (1), Proteobacteria (α (1) и β (1)), а также к двум видаммтДНК и одному виду Dictyochophyceae. Доминантными оказались 6 филотипов, относящиеся ктрём бактериальным филумам и одному виду страменопилов: Planctomycetes (3 филотипа – 41 %от общего числа клонов), Actinobacteria (1 филотип – 26 %), Proteobacteria (1 филотип – 13 %),Stramenopiles (1 филотип – 8 %).
Доминантные филотипы 17R-13, 17R-2 и 17R-18(Planctomycetes) показали 90 % сходства с Schlesneria paludicola, 94,6 % - с Singulisphaera roseaи 88 % - с Blastopirellula marina, соответственно. Филотип 17R-1 (Actinobacteria) показалнаибольшее сходство (98,8 %) с M. pyrenivorans, а филотип 17R-29 (β –proteobacteria) (99,1 %) сLimnohabitans planktonicus.
Филотип 17R-9 (Stramenopiles) оказался родственным (99,9 %) смтДНКN.oceanica,тогдакакфилотип17R-13изPlanctomycetesосталсянеидентифицированным.При изучении верхнего горизонта водного столба озера биоразнообразие (количествофилотипов и их таксономическая принадлежность) трех библиотек существенно различалось.Так библиотеки R1B, 17R и f1R были представлены пятью, шестью и одним доминантнымифилотипами, соответственно.53Таблица 5. Статистические данные для 12 клоновых библиотек1Водный столбГлубинаОбразецОбласть гена16S рРНКЧислоклонов/флотиповЧисло“истинных”клонов/филотиповНА-филотипыИндекс Чао1Индекс ШеноннаУивераИндекс Гуда,%R1B1,3 м17Rv3-v5Исток рекиf1R100 мR100BR1007200 мR200BR2007v4-v816Sv3-v5v4-v8v3-v538/1340/1039/638/840/1331/ 939/938/536/729,3(9,014,9)019(н.д.)7(6,0- 16,6)2,0(1,7-2,2)2,0(1,7-2,2)94970,7(0,3-1,1)95R367A+B367 м37R/31Rf3RR2r2мR2r2v4-v8v3-v5v4-v816Sv3-v5v4-v841/1439/1488/2060/1940/1238/1024/929/929/821/879/1559/1839/1124/620/6101208(7,0-17,6)11(9,2-25)7(н.д.)11(8,3-30,9)22,5(16,3-57,5)119,5(18,130,4)119(13,348,5)1,3(0,9-1,6)1,8(1,5-2,1)1,9(1,6-2,1)1,8(1,5-2,1)2,2(1,9-2,3)2,7(2,5-2,8)1,7(1,3-2,1)9286978192938506,1(6,019,6)1,5(1,11,8)9206,7(6,122,0)1,5(1,11,8)95“Истинные” филотипы – филотипы, прошедшие контроль на контаминацию (БК).
Табличные индексы рассчитывали только для “истинных”филотипов. 1 – все значения даны с учетом минорных филотипов.54В библиотеке R1B по числу клонов превалировали три филотипа филума Actinobacteria (два,родственных “Candidatus” P. limnetica и один – M. pyrenivorans), в 17R – три филотипа филумаPlanctomycetes, а в f1R – филотип, отдаленно родственный хпДНК зелёной водорослиPedinomonas minor. Не было выявлено ни одного филотипа, общего для всех 3-х библиотек.Однако, попарное сравнение позволило выявить один общий доминантный филотип(родственный P. minor) для R1B и f1R библиотек и также один общий доминатный филотип(близкородственный M.
pyrenivorans) для R1B и 17R библиотек. Во всех библиотеках быливыявлены неидентифицированные филотипы: в R1B и f1R – по одному доминантному, тогда какв 17R – два доминантных и один минорный. Кроме того, в библиотеках R1B и f1R были выявленыдва (0R-3, 0R-14) и один (f1R-5) минорных филотипа соответственно, показавших ≥99 % сходствас последовательностями, обнаруженными в домашней пыле и на коже человека (Kong et al., 2012;Täubel et al., 2009; Perkins et al., 2009) и, тем самым, отнесенными к HA-филотипам.Индексы биоразнообразия Шеннона-Уивера и Чао 1 полностью совпали в библиотеках R1B и17R, тогда как в f1R – эти показатели были существенно ниже.
Покрытие всех трех библиотек,исходя их формулы Гуда, составило более 92 %. Выход аналитических кривых на плато, такжеподтверждает высокую степень покрытия, по крайней мере, двух (R1B и 17R) библиотек (табл.5, рис. 12). Исходя из низкого биоразнообразия и наличия только одного доминантного филотипа,составившего по числу клонов почти всю библиотеку f1R, можно сделать предположение о том,что праймеры на полноразмерный ген 16S рРНК были сильно видоспецифичны.Тем самым, амплификация полноразмерного гена 16S рРНК с праймерами на заданныеучастки оказалась существенно хуже в плане “вскрытия” биоразнообразия, чем амплификацияпо двум другим вариабельным участкам гена 16S рРНК.3.4 Анализ микробного разнообразия 100 м горизонта по двум (v3-v5 и v4-v8) областямгена 16S рРНКМикробное разнообразие 100 метрового водного горизонта было изучено путем создания двухгенных библиотек R100B и R1007 на области v3-v5 и v4-v8 гена 16S рРНК, соответственно (Рис.6).
Размер выборки библиотеки R1007 первоначально составил 40 клонов. После сравнения с БКи вычета 4 филотипов-контаминантов окончательная выборка составила 29 клонов и 9 филотипов(покрытие 86 %). Выборка для R100B за вычетом одного контаминанта была представлена 36клонами и 7 филотипами с покрытием библиотеки на 92 % (Табл. 5).Анализ библиотеки R100B показал, что выявленные филотипы относились к 4 бактериальнымфилумам: Actinobacteria (2 филотипа), Verrucomicrobia (1), Proteobacteria (1), Candida divisionOD1 (1) и к 2 эукариотным отделам, отдаленно родственным хпДНК Viridiplantae (1) и55Dictyochophyceae (1).
Отметим, что все 8 филотипов имели 98 % и более сходства с ближайшейпоследовательностью в GenBank. Только 2 филотипа 1R-1 и 1R-4, принадлежащие Actinobacteriaи хпДНК Viridiplantae, являлись доминантными, составляя 56 % и 25 %, соответственно, отобщего числа клонов. Филотип 1R-1, принадлежащий к acI-AVI кладу, (Newton et al., 2007) былсходен на 96,5 % с “Candidatus” P. limnetica (Jezbera et al., 2009), тогда как филотип 1R-4 былсходен на 88 % с Pedinomonas minor.28%R1007-614%ActinobacteriaхпДНК ViridiplantaeмтДНК1R-156%1R-4*25%минорныеR1007-1*30%R1007-428%Рисунок 6. Сравнение доминантных филотипов библиотек R100B и R1007, выявленных в100 метровом горизонте озера Радок, по результатам анализа v3-v5 и v4-v8 областей гена16S рРНК. Звездочкой обозначены неидентифицированные филотипы.Идентификация нуклеотидных последовательностей из библиотеки R1007 показала, чтополученные филотипы относились к 3 филумам бактерий: Actinobacteria (2 филотипа),Proteobacteria (1) и Planctomycetes (2) и 3 отделам эукариот: хпДНК Viridiplantae (1) и мтДНКStramenopiles (2).
Отметим, что все 9 филотипов имели 98 % и более сходства с ближайшейпоследовательностью в GenBank.Доминирующимиоказались3 филотипа:R1007-1,родственный на 88 % с хпДНК P. minor, и составивший около 30 % клонов от всей библиотеки,R1007-4 (28 % от библиотеки) был сходен на 99,9 % с мтДНК N. limnetica, а клон R1007-6 (14 %)показал 98,8 % сходства с M. pyrenivorans.Таким образом, сравнительный анализ библиотек 1R (v3-v5) и R1007 (v4-v8) показал наличиев них двух и трех доминантных филотипов, соответственно. Библиотека 1R была представленафилотипом родственным “Candidatus” P. limnetica (Actinobacteria) и филотипом, отдаленнородственным хпДНК Pedinomonas minor, тогда как R1007 – филотипами, близкородственнымиM.
pyrenivorans и мтДНК N. limnetica (Stramenopiles), а также филотипом, отдаленнородственным P. minor. В итоге, последний филотип оказался общим для обеих библиотек.Анализ последовательностей обеих библиотек показал наличие в них неидентифицированныхфилотипов. Так в библиотеке R100B был выявлен только 1 такой филотип: 1R-4 - доминантный56и родственный на 88 % хпДНК P.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
