Диссертация (1145733), страница 12
Текст из файла (страница 12)
2007).По причине высокой вероятности загрязнения образцов чужеродной ДНК при работеиспользовали стерильные комбинезоны, хирургические перчатки и маски (Tyvek, DuPont иCimberly Clark, USA). Дополнительно к этому все инструменты и рабочие поверхностиобрабатывались специальными деконтаминирующими растворами (Proline Biocontrol, Biohit,Finland). Более подробно все этапы деконтаминации были описаны ранее (Petit et al. 2005).2.4 Бактериальное культивированиеПробы воды из 4-х глубин высевали на стандартную агаризованную среду R2A («Difco»),разведенную в 100 раз. Посевы инкубировали в холодильнике при 4 оС в течение 2-х месяцев.Выросшие колонии отсевали и рассевали на ту же среду для получения чистых культурмикроорганизмов.Все изоляты были морфологически проанализированы.
Из всех выросших колоний былаэкстрагирована геномная ДНК (гДНК) согласно протоколу фирмы-производителя Qiagen(Германия). Для амплификации полноразмерных генов 16S рРНК использовали универсальныепраймеры: 1492R (Eden et al. 1991) и w001mCFm - 5’ - AAG AGT TTG ATC MTG GCT C - 3’(модифицированный праймер w001 (Godon et al., 1997)).Полученные ПЦР-продукты для проверки гомогенности популяции (один вид или смесьвидов) были риботипированы с помощью двух эндонуклеаз рестрикции AluI и HaeIII(“SibEnzyme”, Россия). Выявленные гетерогенные (смесь видов) культуры клонировали иполученные клоны-представители секвенировали.2.5 Экстракция геномной ДНКДля выделения геномной ДНК (гДНК) из образцов воды использовали механическоеразрушение клеток при помощи инструмента FastPrep (“MPBiomedicals”, США) и коммерческийнабор PowerSoil DNA isolation kit (“MoBio Labs”, США) согласно методике фирмы-изготовителя.Экстракцию ДНК проводили в тех же чистых условиях, что и концентрирование водных проб.
Вкачестве контроля на загрязнение во всех случаях проводили экстракцию гДНК без добавленияматериала.422.6 Амплификация генов 16S рРНКДля амплификации области v3-v5 (590 п.о.) генов 16S рРНК использовали пару бактериальныхвырожденных универсальных праймеров 338F и Com2-905Rm (Bulat et al. 2004; Lavire et al. 2006)и метод ПЦР с “горячим стартом”.
Условия проведения ПЦР описаны ранее (Chuvochina et al.2011). Во всех случаях параллельно с опытной ставили контрольную реакцию (негативную ПЦР)с использованием воды Ambion (США) в качестве материала.Амплификацию области v4-v8 (890 и 893 п.о.) генов 16S рРНК проводили с использованиембактериальныхвырожденныхуниверсальныхпраймеров515mF(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTA-3′) и двух частично перекрывающихся «обратных» праймеров1397mR (5′-GGGCGGWGWGTRCAAGGC-3′) и 1391mR (5′-GACGGGCGGWGWGTRCA-3′)также методом “горячего старта”.
На 20 мкл ПЦР смеси вносили 2 ед. полимеразы Roche FastStart(Франция). Амплификацию проводили на термоциклере TProfessional (Biometra, Германия) втечение 33 циклов.Для амплификации полноразмерных генов 16S рРНК были применены универсальныепраймеры: 1492R [Eden et al., 1991; и слегка модифицированный праймер w001 [Godon et al.,1997]: 5’ - AAG AGT TTG ATC MTG GCT C - 3’, где М = А : С. Амплификацию проводили втечение 40 циклов в 20 мкл ПЦР смеси.Продукты ПЦР реакций анализировали методом электрофореза в 1,6 % агарозном геле в 0,5 хTBE-буфере (трис-HCl, борной кислоты, ЭДТА) с окрашиванием SYBR Gold (США) для большейчувствительности.2.7 Молекулярное клонированиеМолекулярное клонирование проводили согласно протоколу компании “Invitrogen” (США) сиспользованием TOPO TA Cloning Kit for Sequencing (“Invitrogen”, США) и химическикомпетентных клеток E. coli (One Shot TOP10). Объем ПЦР продукта необходимого дляклонирования определяли визуально методом гель-электрофореза с использованием ДНКмаркеров определенной концентрации.2.8 ПЦР с вектор-специфичными праймерамиДля проверки наличия вставки в вектор для клонирования использовали ПЦР с векторспецифичными праймерами Bul1 и Bul2 (слегка сдвинутые стандартные М13 праймеры длясеквенирования).
Размеры полученных ампликонов для области v3-v5 и v4-v8 гена 16S рРНК с43учетом размера «спейсера» вектора для клонирования pCR 4 TOPO (221 пара оснований (п.о.))составляли около 810 и 1100 п.о., соответственно.2.9 Приготовление клеточных лизатовКлетки E. coli, высеянные в виде штрихов на чашки со средой LB с добавлением ампицилина(100 мкг/мл), оставляли на ночь при 37 °С. Выросшие колонии отбирали микробиологическойпетлей и вносили в предварительно подготовленные 1,5 мкл пробирки, содержащие по 200 мкллизисного буфера (TE-буфер, 150мМ NaCl и 0,1 % Triton X).
Затем пробирки с клеточнымматериалом помещались на водяную баню и выдерживались в течение 10 мин при 100 °С. Передиспользованием раствора ДНК в дальнейшей работе, разрушенные клетки осаждалицентрифугированием. Приготовленные лизаты хранили при 4 °С.2.10 Риботипирование ДНК фрагментовДля предварительного определения степени разнообразия клоновых библиотек использовалиметод риботипирования с тремя эндонуклеазами рестрикции: AluI, HpaII и HaeIII (“SibEnzyme”,Россия). Для определения размера фрагментов рестрикции использовали маркер 100 bp DNALadder (“New England Biolabs Inc.”, США) с известным содержанием ДНК в определенныхфрагментах. Клоны, одинаковые по рестрикционным профилям, выявленным на основепоследовательного использования трех эндонуклеаз рестрикции, объединяли в один риботип.Представители каждого риботипа в количестве от одного до трех клонов секвенировали поСэнджеру (LGC Genomics, Берлин, Германия).2.11 Очистка ДНКПолученные ампликоны очищали от побочных продуктов и компонентов ПЦР реакции спомощью набора MinElute Purification Kit (“Qiagen”, Германия) согласно протоколупроизводителя.
Количество ДНК оценивали визуально с помощью электрофореза в 1,6 %агарозном геле в 0,5х TBE-буфере с использованием ДНК маркеров.2.12 Секвенирование ДНК фрагментовОпределение нуклеотидной последовательности отобранных представителей всех риботипов44с концентрацией очищенной ДНК не менее 100 нг/мкл в образце проводили в компании LGCGenomics GmbH, (Берлин, Германия).2.13 Анализ нуклеотидных последовательностейПолученные ДНК последовательности анализировали с помощью программы Chromas Lite2.01. Множественное выравнивание и сравнение нуклеотидных последовательностей проводили,используяпрограммуCLUSTALW2(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html).Нуклеотидные последовательности, показывающие >98 % сходства между собой, а такжеодинаковый перечень последовательностей в мировой базе Genbank с использованиемпрограммы BLAST http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), объединяли в один филотип или ОТЕ.Выявленные филотипы сравнивали сперва с собственной БК (базой контаминантов) (Bulat et al.2004), содержащей бактериальные филотипы из разного рода контрольных реакций (холостаяэкстракция гДНК, негативная ПЦР и пр.).
Идентификацию филотипов, прошедших тест наконтаминацию,проводилиприпомощиалгоритмаBLASTиRDP(http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp). Последовательности, показавшие ≤ 90 % сходства сближайшими известными (опубликованными) таксонами, относили к неидентифицированнымфилотипам, тогда как филотипы, которые нельзя было отнести ни к одному из известныхфилогенетических разделов определяли, как неклассифицируемые. Филотипы, представленныетремя и более клонами в клоновой библиотеке, рассматривали как доминантные. Филотипы,показавшие в GenBank ≥98 % сходства с ОТЕ, выявленными при изучении микробиоты человека(здоровых и больных), были отнесены к HA-филотипам (Human Associated – связанные счеловеком), рассматриваемым как контаминанты человеческого происхождения.Построение филогенетического дерева проводили методом “максимального правдоподобия”с помощью программного пакета MEGA6 (Kumar et al.
2008). Статистическую достоверностьтопологии выбранного дерева оценивали методом бутстрэп - анализа 500 альтернативныхдеревьев в той же программе. Клоны (нуклеотидные последовательности), представляющиевыявленные филотипы, депонированы в базу данных GenBank под номерами: JF901736 JF901755, KR811200 - KR811209.2.14 Статистический анализОценку достаточности покрытия клоновых библиотек рассчитывали по формуле Гуда: (1 n/N) x 100, где n – это число единичных клонов, N - общее число клонов в библиотеке [Good,1953], а также путем построения аналитических кривых (тест «Rarefaction») с помощью45программы aRarefact Win 1.3 (http://strata.uga.edu/software/anRareReadme.html).
Для расчетаиндексов разнообразия Shannon–Weaver (География и мониторинг биоразнообразия, 2002) ииндекса видового богатства Chao1 (Chao, 1984) использовали программу DOTUR 1.53 (Schlossand Handelsman 2005). Входные данные для программы подготавливали с помощью программCLUSTALW2 и Phylip DNADist (http://mobyle.pasteur.fr/cgi-bin/portal.py?form=dnadist). В связи стем, что секвенировались только репрезентативные клоны от каждого риботипа, допускали, чтонесеквенированыеклоны,входящиевпоследовательности на 100 % между собой.одинриботип,сходныпонуклеотидной463 Результаты и обсуждениеВсего для 4-х горизонтов водного столба озера и дополнительного образца истока рекиМежозерная было создано 14 клоновых библиотек и проанализировано 540 клонов по тремобластям генов 16S рРНК. Все исследуемые клоны были объединены в рибогруппы,представители которых были секвенированы.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
