Сведения о результатах публичной защиты (1145700), страница 2
Текст из файла (страница 2)
по актуальности, научной новизне, объему выполненных исследований, теоретической и практической значимости результатов диссертация соответствует требованиям «Положения о порядке присуждения ученых степеней», утвержденного Постановлением Правительства Российской Федерации йв 842 от 24.09.2013, в действующей редакции от 02.08.2018, предъявляемым к диссертациям на соискание ученой степени кандидата наук, а Колобов Алексей Александрович заслуживает присуждения ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.03.04 — биохимия. Соискатель имеет 8 опубликованных работ по теме диссертации, в том числе 2 статьи, опубликованные в рецензируемых научных изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки России, 5 тезисов в материалах всероссийских и международных конференций и 1 поданную заявку на патент.
Наиболее значительные работы по теме диссертации: Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК: Колобов А.А., Кондратьева Е.В., Кудлинг Т.В., Карасев М. М., Калинин Р.С., Хижина А.А., Нимирицкий П.П., Стефанов В.Е., Петров А.В. Получение ИЛ-36РА человека в ЕзсЬепсЫа со// при коэкспресии с метионинаминопептидазой Е. со//. !. Сравнение продукции ИЛ-36РА различными штаммами // Цитология. -2017. — т. 59 — йв 7. — С. 482-488. Колобов А.А., Кондратьева Е.В., Шарафутдинова Т.А., Калинин Р.С., Нимирицкий П.П., Стефанов В.Е., Петров А.В, Получение ИЛ-36РА человека в Езс/!ег/сЛ/а со// при коэкспресии с метионинаминопептидазой Е.
со//. !!. Сравнение биологической активности ИЛ-38РА от различных штаммов // Цитология. — 2017. — т, 59 — Из 8. — С. 534-538. Заявки на патенты: Колобов А.А., Кондратьева Е.В., Нимирицкий П.П., Кудлинг Т.В., Сергеева Д.С., Карасев М.М., Петров А.В. Способ получения безметионинового рецепторного антагониста Интерлейкина-36, штамм бактерий ЕзсЬепс///а со// В!.21 !0ЕЗ) — продуцент безметионинового рецепторного антагониста Интерлейкина-36 (варианты), способ их получения, плазмидные векторы рВАО15А и рЕТ15А и последовательность ДНК для их получения // Заявка на патент на изобретение — 08.02.2017 — Нв 2017103888 (008832) На автореферат диссертации поступило 6 отзывов.
Все отзывы являются положительными. Отзывы прислали; 1. Тотолян Арег Артемович, доктор медицинских наук, профессор, академик РАН, директор ФБУН «Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера». Отзыв положительный, замечаний не содержит. 2. Иванов Андрей Михайлович, доктор медицинских наук, профессор, чл.-корр. РАН, заведующий кафедры клинической биохимии и лабораторной диагностики ФГБ ВОУ ВО «Военно-медицинская академии им. С.
М. Кирова». Отзыв положительный, замечаний не содержит. 3. Гусев Николай Борисович, доктор биологических наук, профессор, чл.-корр. РАН, заведующий кафедры биохимии биологического факультета ФГБОУ ВО «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова».
Отзыв положительный, содержит 2 вопроса: 1) Почему в своей работе диссертант использовал две разных плазмиды, нельзя ли было получить полицистронную плазмиду, последовательность которой содержала бы информацию как о целевом белке, так и о метионинаминопептидазе? 2) Было бы желательным провести масс-спектрометрическое определение молекулярной массы модифицированного белка и показать, что убыль его массы точно соответствует удалению аминогруппы, а не связано, например, с окислением остатков цистеина и/или метионина, которое легко происходит при щелочных значениях рН (рН 9,0), которые были использованы в ходе работы. 4. Морозова Алевтина Владиславовна, кандидат биологических наук, научный сотрудник отдела клеточных культур ФГБУН «Институт цитологии Российской академии наук». Отзыв положительный, замечаний не содержит.
8. Зурочка Александр Владимирович, доктор медицинских наук, профессор, ведущий научный сотрудник лаборатории иммунологии воспаления ФГБУН «Институт иммунологии и Физиологии» Уральского отделения РАН, г. Екатеринбург. Отзыв положительный, замечаний не содержит. 8. Колодкин Николай Иванович, кандидат химических наук, старший научный сотрудник лаборатории химии пептидов ФГУП Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов" Федерального медика-биологического агентства России, г.
Санкт-Петербург. Отзыв положительный, содержит 1 вопрос: 1). Диссертанту удалось подобрать условия хранения белка в растворе, исключающие деструкцию последнего. При этом Алексей Александрович полагает, что лиофильное высушивание белков часто провоцирует их окисление и агрегацию. Наблюдалось ли это явление для антагониста рецептора интерлейкина-36 или это только предположение? На вопросы в отзыве Н.Б. Гусева диссертант дал следующие ответы: 1) Полицистронные плазмиды, несущие гены, кодирующие ИЛ-36РА человека и метионинаминопептидазу Е. со//, также были нами созданы, но не были использованы в этой работе.
Их удалось получить существенно позже описанных в работе штаммов, поэтому их применение потребовало бы повторного масштабирования процесса культивирования штаммапродуцента и повторного проведения части доклинических исследований. Кроме того, при культивировании зтих штаммов не удалось добиться существеннага прироста продукции ИЛ-36РА по сравнению с использованными в работе. 2) Такое исследование было проведено. Факт отщепления аминогруппы от остатка Азп139 подтвержден методом масс-спектрометрии. На вопрос в отзыве Н.И. Калодкина диссертант дал следующий ответ: В случае ИЛ-38РА зто является лишь предположением.
Эксперименты по лиофильному высушиванию ИЛ-36РА не проводили, т.к. представлялось возможным подобрать условия его долговременного хранения в неизменном виде в растворе. Такие условия были найдены. Таким образом, лиофильное высушивание ИЛ-36РА только усложняло бы технологию его получения. В отзывах на автореферат отмечается актуальность темы исследования, теоретическая и практическая значимость полученных результатов.
Отмечается, что результаты диссертации углубляют понимание биохимии рецепторного антагониста Интерлейкина-36, а также имеют высокую практическую ценность. Все отзывы содержат вывод о соответствии диссертационного исследования требованиям «Положения о порядке присуждения ученых степенейэ, утвержденного Постановлением Правительства Российской Федерации На 842 от 24.09.2013, в действующей редакции от 02.08.2016, предъявляемым к диссертациям на соискание ученой степени кандидата наук, и том, что диссертант заслуживает присвоения степени кандидата биологических наук. Выбор официальных оппонентов и ведущей организации обоснован высокой квалификацией выбранных специалистов в области и научным авторитетом в исследовательском сообществе.
Оппоненты являются работниками разных организаций, в которых осуществляется их трудовая деятельность. Ведущая организация является известным научным центром России, а ее сотрудники имеют публикации, связанные с проблематикой диссертации. Диссертационный совет отмечает, что в результате выполненных соискателем исследований: ° Разработан оригинальный метод получения биологически активного ИЛ-36РА с отщепленным )ч-концевым остатком метионина в штамме-продуценте на основе бактерии ЕзслепсЫа сод и его дальнейшей очистки для получения фармацевтической субстанции ИЛ-36РА, в масштабе пилотного промышленного производства.
° Выявлена способность ИЛ-36РА в процессе его выделения к спонтанному дезамидированию по остатку Азп139 при повышении рН среды выше 7,0. «Показано отсутствие влияния дезамидирования остатка Азп139 в молекуле ИЛ-36РА на его биологическую активность. ° Предложены методы количественного определения дезамидированной, окисленной и метианиновой форм ИЛ-38РА на основе ВЭЖХ и капиллярного электрофореза. ° Доказана способность получаемого рекомбинантного ИЛ-36РА человека подавлять активацию рецептора ИЛ-36 в модельной системе )и ИГго, а также подавлять кожное воспаление в модели псориазоподобного дерматита на мышах. » Предложена композиция фармацевтической субстанции ИЛ-36РА, способная обеспечивать хранение ИЛ-36РА без изменения его физико-химических и биологических свойств не менее года. Теоретическая значимость работы обоснована тем, что полученные результаты углубляют понимание механизма действия ИЛ-36РА за счет доказательства отсутствия влияния дезамидирования остатка Азп139 в молекуле ИЛ-36РА на его биологическую активность, а также за счет выявления способности ИЛ-36РА человека эффективно купировать кожное воспаление в модели индуцированного псориазоподобного дерматита на мышах.
Применительно к проблематике диссертации результативно использован комплекс биохимических и молекулярно-биологических методов и подходов, включающий создание экспрессионных плазмидных векторов методами генной инженерии, создание и культивирование штаммов-продуцентов на основе ЕзспепсЫа соН, крупномасштабную хроматографическую очистку получаемого рекомбинантного ИЛ-36РА, определение его физико-химических свойств с использованием методов высокоэффективной жидкостной хроматографии и капиллярного изоэлектрофокусирования, определение его биологической активности с использованием культур клеток и модели псориазоподобного дерматита на мышах. Практическая значимость работы обоснована тем, что разработана технология получения фармацевтической субстанции ИЛ-36РА человека с доказанной биологической активностью в масштабе пилотного промышленного производства.
Значение полученных соискателем результатов для практики подтверждается тем, что: ° Разработан и внедрен метод получения и очистки рекомбинантного ИЛ-36РА человека с отщепленным й-концевым остатком метионина, позволяющий получать до 10 г очищенного препарата за один производственный цикл.
° Создана материальная база для получения препарата в количествах, необходимых для проведения доклинических и первой фазы клинических испытаний. ° Модернизировано и расширено содержание практического курса «Биохимические и молекулярно-биологические методы анализа генома» для студентов магистратуры кафедры биохимии ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный университет» с использованием результатов выполненной работы.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
