Диссертация (1141387), страница 16
Текст из файла (страница 16)
На основании этого можно утверждать, чтоданный компонент является продуктом гидролиза в кислых условиях.Таким образом, простые методы - химические реакции и также болеесовременные – УЭЖХ и МС, подтверждают, что полученный СЭСЛ содержитсумму сапонинов стиракса лекарственного.1104.4. Стандартизация СЭСЛНаоснованиирезультатовизученияхимическогосоставаСЭСЛполученного по методике 4.2. в целях стандартизации предполагаются следующиепоказатели: описание, растворимость, сыпучесть, влажность, подлинность иколичественное определение содержания сапонинов.4.4.1.
Описание СЭСЛВнешний вид СЭСЛ: Сухой очищенный экстракт стиракса представляетсобой аморфные частицы от светло-кремового до кремового цвета с серымоттенком, со специфическим запахом (Рис 4.15.).Рисунок 4.15. Внешний вид СЭСЛМикроскопические признаки СЭСЛ: Одной из характеристик любогопорошка и сухого растительного экстракта, в том числе является форма и размерчастиц. Форму частиц СЭСЛ определяли с помощью СЭМ.Как видно из рисунка 4.16., частицы сухого экстракта стираксалекарственного имеют различные размеры и форму. Частицы многоугольные, сломаными краями иногда удлиненные иногда округлые. Поверхность частиц –покрыта выступающими многогранными образованиями.
Даже округлые частицыимеют очень неровную поверхность. Неровная поверхность частиц не позволяетим скользить относительно друг друга.111Рисунок 4.16. Микрофотографии частиц порошка сухогоэкстракта стираксалекарственного при разных увеличениях (СЭМ)В таблице (4.8.) представлен анализ размера частиц экстракта, проведенныйпо полученным микрофотографиям.112Таблица 4.8.
– Диаметры (мкм) частиц порошка СЭСЛИсследуемыйобъектМелкиечастицы, мкмСредниечастицы, мкмКрупныечастицы, мкмпорошок сухогоэкстракта стираксалекарственного0,8460,8050,9421,0000,7250,3600,5350,3480,7431,0901,3301,1702,864,437,318,347,088,598,095,938,323,594,627,0016,3217,3910,1517,0510,6110,0212,8921,1914,8517,9424,3210,50Среднее значение0,825±0,3066,35±2,0115,27±4,64Как видно из приведенных в таблице 4.8. результатов исследования,порошок СЭСЛ полидисперсный и диаметры частиц варьируют в широкомдиапазоне.4.4.2. Определение растворимости СЭСЛРастворимость СЭСЛ определяли по методике ГФ XIII, ОФС 1.2.1.0005.15при комнатной температуре.
Результаты растворимости представлены в таб. (4.9.).Таблица 4.9. – Результаты определения растворимости СЭСЛ при (20± 2)°C№опыта12345678910111213Растворитель /Система растворителейВода очищеннаяВода очищенная + ТЭАВода очищенная +трометамолВода очищенная +NaOHСпирт 95%МетанолГлицеринАцетонПропиленгликольДиметилсульфоксидПолиэтиленгликоль-400Хлороформн-бутанолПримерное количестворастворителя (мл),необходимое длярастворения 1 г вещества1:10001:101:101:101:1001:201:1251:201:2001:201:10001:2001:2000ОбозначениярастворимостиМало растворимРастворимРастворимРастворимУмернно растворимРастворимМало растворимРастворимМало растворимРастворимМало растворимМало растворимОчень мало растворим113В процессе исследования было установлено, что сумма сапонинов в сухомэкстракте растворима в ацетоне, метаноле и диметилсульфоксиде.
Однако,использование этих растворителей в лекарственной форме исключено, посколькуэти растворители небезопасны и могут вызывать раздражение и пенетрантноедействие. Поэтому для дальнейшей работы была выбрана система растворителейвода очищенная + трометамол (опыт 3).4.4.3. Определение степени сыпучести сухого экстрактаОдним из технологических свойств сухих растительных экстрактовявляются характеристики сыпучих материалов.
Поэтому нами были определенытехнологические характеристики экстракта стиракса лекарственного: сыпучесть,угол естественного откоса, насыпная плотность, насыпная масса и коэффициентпрессуемости. Результаты, представленные в таблице (4.10.), демонстрируютнеудовлетворительные технологические характеристики у изучаемого экстракта,полученного по нашему методу. В результате проведенных испытаний, полученыследующие данные:=33,39; V0=78 смЗ; V10=76 смЗ; V500=58 смЗ; V1250=58 смЗ.Таблица 4.10. – Технологические характеристики порошка СЭСЛСыпучесть,Уголг/сНасыпнаяестественногомасса,Насадкамм±откоса,гград0,01101525Насыпнаяплотность,г/смЗ010 0,439±0,010,428±0,0268±20500 0,575±0,0104.4.4.
Влажность СЭСЛИндексКарраКпр %ИндексХауснера25,641,343Влажность полученного сухого экстракта составляет 6,5 % (таблица 4.11).Таблица 4.11. – Влажность СЭСЛ ˗ (n=6, Р=95%) (t0,95, 5 = 2,571).Влажность СЭСЛ %̅6,5SSr %0,80212,346∆0,846̅ ± ∆6,5±0,81144.4.5. Количественное определение содержания сапонинов для контролякачества сырьяКоличественное содержание сапонинов в сухом экстракте стираксалекарственного определяли при помощи, разработанной и валидированнойметодики ЯМР- 1Н, изложенной в главе 2 (см. п.
2.2.7.). Для сапонина В былвыбран сигнал при 5.94 м.д., для сапонинов А и С выбрана совокупность сигналовв области 5.70-5.8м.д. Сигналов дезацилсапонина, не перекрывающихся другимисигналами, не обнаружено. В результате получено содержание сапонина В = 2,7 ±0,1 мг (5,8 ± 0,21%), суммы сапонинов А и С = 10,4 ± 0,21 мг (22,5 ± 0,45%)(Рисунок 4.17.). Содержание сапонинов А, В, С в образцах сухого экстрактастиракса лекарственного составило от 28,3 до 29%.
Установлена нормасодержания суммы сапонинов в сухом экстракте стиракса лекарственного неменее 27%.Рисунок 4.17. Спектр ЯМР 1Н сухого экстракта стиракса лекарственногоНа основании проведенных экспериментов по стандартизации СЭСЛразработан нами проект НД «Стиракса лекарственного экстракт сухой(СЭСЛ)»- приложение № 5.1154.5. Изучение стабильности при хранении СЭСЛ:С целью изучения стабильности СЭСЛ в процессе хранения и дляустановления его срока годности нами были заложены образцы СЭСЛнахранение при температуре (25,0±5°С и влажности 60±2%) - комнатнаятемпература. Исследования показателей качества были проведены каждые 6месяцев на протяжении 24 месяцев.
Результаты анализа СЭСЛ представлены втабл. 4.12.Таблица 4.12. – Результаты изучения стабильности СЭСЛ при хранении притемпературе 25±5°C и влажности 60±2%.ПоказателикачестваМетод и нормаморфные частицы от светлокремового до кремового цветаОписаниессерымоттенком,соспецифическим запахом.1) качественные реакции:реакция пенообразованияреакция гемолиза2) УФ: Наличие характерныхмаксимумов поглощенияпри 270±1 нм и 315±1 нм.3) ТСХвсистемехлороформ-метанол-водаПодлинность(6:3:1) (УФ-свет, 245 нм/детектор- раствор взвесидефибринированнойкрови).НаТСХобнаруживаютсязоныадсорбции белого цвета сRf около (0,68( (сапонины).растворима в ацетоне,метаноле,диметилсульфоксиде,Растворимоствода+ТЭА,ьвода+трометамол,вода+NaOH.1) Насыпная масса:0,428±0,02 г2) Насыпная плотность,Сыпучестьг/смЗρ_100,439±0,01ρ_5000,575±0,010Сроки хранения, мес6121824соотв.
соотв.соотв.соотв.соотв.соотв. соотв.соотв.соотв.соотв.соотв. соотв.соотв.соотв.соотв.соотв. соотв.соотв.соотв.соотв.Влажность %6,5±0,85,76,25,66,16,7СодержаниесапониновЯМР 1Hне менее 27%28,527,930,328,328,1116Как видно, из представленных данных в таблице 4.12., СЭСЛ соответствуеттребованиям по всем показателям качества и позволяет уставить срок годности втечение 24 месяцев.4.6.Определение биологических свойств СЭСЛ4.6.1.
Оценка активности БАВ Styrax officinalis в опытах in silicoОдно из фармакологических действий сапонинов это спермициднаяактивность. Прежде чем выделять БАВ и разрабатывать лекарственную форму наоснове сапонинов стиракса мы изучили их фармакологическую активность insilico. На рисунке 4.18.
показан механизм действия сапонинов на липидныйбислой в плазматической мембране сперматозоидов. Действие сапониновприводит к везикуляциям и вакуолизациям. Эти эффекты разрушают мембрану итем самым приводят к разрушению спермиев.Мы предполагаем такие же эффекты у сапонинов стиракса лекарственного.Рисунок 4.18. Схема спермицидного действия сапонинов [Augustin J.M. et al. 2011]117Чтобы понять, обладают ли сапонины стиракса спермицидной активностьюи какие ещё свойства они могут проявлять in vivo, была проведена оценкафармакологических свойств сапонинов стиракса с помощью компьютерногомоделирования молекул сапонинов стиракса и их взаимодействия с различнымирецепторами, ферментами и др.Компьютерная оценка плейотропного действия сапонинов стираксалекарственного на основе анализа зависимостей «структура-активность» сиспользованием программы PASSХимические соединения имеют широкий спектр биологической активности.Прогнозирование спектров активности веществ (Prediction of Activity Spectra forSubstances) (PASS) представляет собой программу, используемую для анализаобщей комплексной активности: фармакологическую активность, токсичность,механизм действия, метаболические условия на основе взаимосвязи структурныхформул и активности (SAR) с точностью 95%.Компьютерная визуализация химических структур сапонинов стиракса:2D химические структуры сапонинов стиракса (А, В, С, стираксдезацилсапонин) были составлены с использованием пакета Marvin Sketch 2017.
Вкачестве входной информации в программе PASS и сайте Swiss Dockиспользуется информация о структурной формуле молекулы, представленная ввиде файла в формате Mol file, либо в виде файла в формате SD file.Химическиедезацилсапонин)структурыбылисапониновопределенысстираксапомощью(А,В,ЯМРвС,стиракспредыдущихопубликованных статьях (R. Segal-1964, Y. Yayla - 2002). Структуры сапониновстиракса были составлены с использованием пакета MarvinSketch 2017,принадлежащего Chem Axon Ltd и сохранились в виде файлов (Mol file, SDF file,JPEG, PDF).В рисунке 4.19. представлены геометрически оптимизированные структурыстиракс-сапонинов в 2D-форме.118Рисунок 4.19.
Структура стиракс-сапогенина (В) в окне программы Marvin SketchСапонин стиракса АСапонин стиракса ССапонин стиракса ВСтиракс дезацилсапонинРисунок 4.20. 2D химические структуры сапонинов стиракса А, В, С и стираксадезацилсапонин119Прогнозированиебиологическойактивностихимическихструктурсапонинов стиракса / Prediction of activity for chemical structure of styrax saponinsИзучениеспецифическойфармакологическойактивностисапониновстиракса проводилось с помощью программы PASS.КомпьютернаяпрограммаPASSоцениваетвероятныйпрофильбиологической активности структурной формулы органического соединения,молекулярная масса которого находится в интервале 50 - 1250.В программе PASS биологическая активность представлена качественнымобразом (активно/неактивно)с оценками вероятности проявления активности: Pa –соединение активно; Pi - неактивно.Конечную информацию мы получили в виде списка прогнозируемых видовактивности с оценками Pa и Pi, которые могут принимать значения в диапазоне от0,000 до 1,000.
Шанс обнаружить конкретную активность в эксперименте темвыше, чем больше значение Pa и меньше значение Pi для данной активности.Для анализа в программе использовались химические формулы стираксдезацилсапонина, сапогенина стиракса А, сапогенина стиракса В и сапогенинастиракса С - несахарная часть сапонинов стиракса А, В, С, полученнаягидролизом.Результаты показали, что дезацилсапонин имеет 283 прогнозируемыеактивности, около 60 из них с высокими значениями Pa и низкими значениями Pi.Такоесочетаниепоказателейпрогнозируетвысокуюфармакологическуюактивность.Некоторые из высоких ожиданий: гепатопротектор (Pa: 0,992, Pi: 0,001),ингибитор экспрессии ICAM1 (Pa: 0,971, Pi: 0,000), стимулятор Caspase3 (Pa:0,970, Pi: 0,002) и других. Полученные результаты представлены в табл. 4.13.120Таблица 4.13.
– Результаты прогнозирования биологической активностихимических структур сапонинов стиракса с помощью программы PASSстираксдезацилсапонинбиологическаяактивностьcапогенинстиракса Aсапогенинстиракса Вcапогенинстиракса CPaPiPaPiPaPiPaPiГепатопротекторная0,9920,0010,9730,0010,9270,0020,9440,002Контрацептив0,5070,0070,3860,0130,4420,0100,3810,013антагонист целостностимембраны0,8400,0050,6860,0150,8630,0040,7780,008ингибитор экспрессииICAM10,9710,0000,9810,0000,8160,0010,8330,001Противоопухолевая0,9340,0040,9510,0040,9260,0050,9300,005ингибитор пероксидазылипидов0,8720,0030,9190,0020,8310,0030,8100,003стимулятор Caspase 30,9700,0020,8960,0040,9120,0030,8310,005агонист апоптоза0,8380,0050,8700,0050,8070,0080,8480,005Химиопрофилактическая0,9510,0020,8660,0030,8980,0020,8940,002противоопухолевая(рак яичников)0,6980,0040,8640,0030,8370,0030,8180,003Противовоспалительная0,8430,0050,8300,0050,8200,0050,8430,005Противогрибковая0,8180,0040,7050,0090,6050,0180,6970,010противовирусная(грипп)0,7780,0060,6680,0080,7450,0040,7630,004ингибиторальфаглюкозидазы0,8770,0010,2480,0040,3820,0030,3360,003Как видно из приведённых в табл.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
