Диссертация (1141387), страница 15
Текст из файла (страница 15)
4.3.).На ТСХ видны зоны адсорбции белого цвета с Rf около 0,68 (ССС) и Rf около0,55 (сапонины СО PQS).95Рисунок 4.3. Хроматограмма растворов сапонинов из; а – СЭСЛа, б – СО PQSвсистеме хлороформ-метанол-вода (6:3:1), (УФ-свет, 245 нм/ детектор-растворвзвеси дефибринированной крови).4.3.2. Регистрация УФ-спектрофотометрия СЭСЛ и СССОколо 0,010 г СЭСЛ помещают в мерную колбу вместимостью 10 мл,растворяют в метаноле и доводят объем до метки (раствор А). Выделенную спомощью препаративной ТСХ ССС помещают в метанол последовательнофильтруют через целлюлозный, а затем через шприцевый фильтр CHROMAFILXtra PTFE (Тефлон) с размером пор 45 мкм (раствор Б).УФ-спектр раствора А и Б снимают на спектрофотометре АКВИЛОН СФ-102в кювете с толщиной слоя 1 см.
В качестве раствора сравнения используютметанол. Результаты УФ-спектрофотометрии приведены на рисунке (4.4.)Рисунок 4.4. УФ-кривые спектрального сканирования растворов сапониновстиракса лекарственного (А- СЭСЛ; Б- ССС).96Полученныйспектрможетбытьвдальнейшемиспользовандлястандартизации СЭСЛ и препаратов на его основе. В проекте НД: УФ-спектрпоглощения 0,1% метанольных растворов сапонинов, выделенных из стираксалекарственного в области от 230 до 365 нм должен имеет максимум поглощенияпри длине волны 270 ± 1 нм и 315 ± 1 нм.4.3.3.
Изучение СЭСЛ и ССС с помощью ВЭЖХПри проведении исследования СЭСЛ, массой 0,01 г растворяли в 5 млметанола, фильтровали через фильтр ПТФЭ с размером пор 0,2 мкм. Также в 1 млметанола растворяли ССС, и фильтровали полученные растворы через фильтрПТФЭ. Для ВЭЖХ использовали (JASCOPU-980 Intelligent HPLC Pump,JASCOUV-970 Intelligent UV/VIS Detector) и колонку C18, и мобильную фазуметанол:вода в соотношении (70:30), скорость элюции составляла 0,5 мл/мин;детектирование при 260 нм. Использовали объем хроматографируемых образцовэкстрактов по 10 мкл. Нами был получен ВЭЖХ-спектр для СЭСЛ и ВЭЖХспектр для ССС (Рисунок 4.5.).абРисунок 4.5. ВЭЖХ-УФ (260 нм) профили растворов сапонинов стираксалекарственного (а – СЭСЛ; б – ССС ).ВЭЖХ–хроматограмма ССС показывает 4 пика. В связи с тем, чтосапонины имеют сходные физико-химические свойства, их разделение данным вотсутствие стандартов является затруднительным.974.3.4.
Анализ сапонинов в СЭСЛ с помощью УЭЖХ-МСВРСухой образец СЭСЛ массой 2,14 мг растворяли в 1 мл метанола ифильтровали (фильтр Clean 2, 0.2 мкм).УЭЖХ система включала автоматический пробоотборник, бинарный насоси диодный детектор (ДД) для регистрации метаболитов, поглощающих в области190-500 нм. Разделение метаболитов проходило на колонке Acquity UPLC ® BEHPhenyl column (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters Corporation, Wexford, Ireland).
Дляэлюированияметаболитовиспользовалиградиентдвухрастворов:0,1%муравьиная кислота (A) и ацетонитрил (Б). Градиент: 0−0,5 мин, 0,1% Б в A;0,5−10,0 мин, 0,1−95,0 % Б в A (линейный градиент); 10,0−13,0 мин, 95% Б в А(изократический режим); 13,0 – 15,0 мин, промывка и стабилизации колонки.Скорость потока растворителя – 0,5 мл в минуту, объем вводимого образца –5 мкл (таблица 4.4).УЭЖХ система была соединена с масс-спектрометром (МС) высокогоразрешения (МСВР, Thermo Scientific Qexactive Orbitrap spectrometer 2.5) cнагреваемым источником ионизации метаболитов в распыленном виде (HESI).Анализировали как положительные, так и отрицательные ионы в диапазоне150−2000 Да. Разрешающая способность масс-спектрометра – 140000. УЭЖХМСВР система функционировала под управлением программы ThermoXcalibur3.0.63.Идентификацию метаболитов проводили с использованием баз массспектрометрическихданных«TheHumanMetabolomeDatabase»«Metlin»,(https://metlin.scripps.edu/),(http://www.hmdb.ca/),«ChemSpider»(http://www.chemspider.com/), «MassBank» (http://www.massbank.jp/), а такжеинформации, опубликованной в литературе (Yaylaetal., 2002).Таблица 4.4.
– Условия анализа сухого экстракта стиракса с помощьюУЭЖХ-МСВРNumberCodeDWT, mgMethanol, ml12StyrNStyrP10.710.711Delution(methanol), ml0.2/0.80.2/0.8Inject,µl55ModeNegativePositive98Типичная хроматограмма УЭЖХ-МС представлена на рис. (4.6.).Рисунок 4.6. УЭЖХ-МС профиль отрицательных m/zв диапазоне 1100-1300,характерных для сапонин гликозидов Styrax officinalisL. Профиль экстрагировалииз хроматограммы всех отрицательных ионов 150-2000 Да.Мы идентифицировали часть пиков, с помощью данных справочнойлитературы.
Результаты представлены в таблице (4.5.).99Таблица 4.5. – Хроматографические и масс-спектрометрические данныеметаболитов экстракта StyraxofficinalisL., полученные методом УЭЖХ-УФ-МСВРи использованные для идентификации сапониновЗначениеРассчитаннаяМоноизото[ M+H]+ аддуктамолекулярная-пнаяметаболита, m/zформуламасса, Да3,7481137,5626C61H84O201136,55565,5701261,6195C61H96O271260,61395,7121283,5994C70H90O221282,5924Styraxsaponin B1; Yayla et al., 20021283,5994C63H94O271282,5983Styraxsaponin B; Yayla et al., 20025,7591261,6195C61H96O271260,61395,8641283,5994C70H90O221282,5924Времямин.Название метаболита/ СсылкаStyrax-deacylsaponin; Yayla et al.,2002Styraxsaponin A1; Yayla et al., 2002Jegosaponin A; Yoshikawa et al., 2000Styraxsaponin A2; Yayla et al., 2002Jegosaponin B; Yoshikawa et al., 2000Styraxsaponin B2; Yayla et al., 2002Styraxsaponin C1; Yayla et al., 20025,9581275,6307C69H94O221274,6237Jegosaponin D1; Yoshikawa et al.,2000Styraxsaponin C2; Yayla et al., 20026,0631275,6307C69H94O221274,6237Jegosaponin D2; Yoshikawa et al.,2000Styraxsaponin C3; Yayla et al., 20026,1861275,6307C69H94O221274,6237Jegosaponin D3; Yoshikawa et al.,20004.3.5.
Анализ сапонинов в СЭСЛ с помощью МС-спектрометрии врежиме регистрации позитивных и негативных ионовРезультаты исследования получены на оборудовании кафедры химииприродных соединений Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова .Благодарим старшего научного сотрудника к.х.н. Ташлицкого В. Н.100Пробоподготовка: Приготовлен раствор 20 мг образца в 1 мл метанола.Анализировали аликвоту 5 мкл. Условия анализа: Хроматографический метод:растворитель A: муравьиная кислота 20 мM- вода, растворитель B: муравьинаякислота 20 мM- ацетонитрил.
Колонка:сорбентом AcquityBEHC18;стальная, 2,1×150 мм, заполненнаяразмер частиц 1,7 мкм; (Waters); температураколонки: 35°С (таблицы 4.6., 4.7.).Таблица 4.6. – Условия анализа сухого экстракта стиракса с помощью МСспектроскопии1234Время (мин)Initial3030,134Скоростьпотока, мл/мин0,30,30,30,3%A90409590%B1060510Curve666Таблица 4.7. – Условия анализа сухого экстракта стиракса лекарственного спомощью МС-спектроскопииУсловия детекции в режиме регистрацииУсловия детекции в режиме регистрациипозитивных ионов:негативных ионов:PolarityES+PolarityES-Capillary(kV)3,5Capillary(kV)3Cone(V)50Cone(V)-50Extractor(V)4Extractor(V)-4RF(V)0,5RF(V)0,2SourceTemperature(°C)120SourceTemperature (°C)120DesolvationTemperature (°C)450DesolvationTemperature (°C)450ConeGasFlow(L/Hr) 50ConeGasFlow(L/Hr) 50DesolvationGasFlow(L/Hr) 800DesolvationGasFlow(L/Hr) 500Нами были изучены МС-спектры в режиме регистрации позитивных инегативных ионов для наиболее интенсивных пиков:1011) Пик со временем удерживания около 16 мин имеет предположительномолекулярный ион М-Н=1219 и М+Na=1243, который может соответствоватьожидаемой структуре для стиракс дезацилсапонин (Рисунок 4.7.).102Рисунок 4.7.
МС-спектры в режиме регистрации позитивных и негативных ионоврастворов сапонинов стиракса лекарственного пик (16 мин, M- Н=1219,М+Na=1243)2) Пик со временем удерживания около 18,2 мин. имеет предположительномолекулярныйионМ-Н=1261иМ+H=1263.Предположительноданноесоединение является стиракс сапонин A – где MF: C61H96O27; мол. м.: 1261.398г/моль (Рисунок 4.8.).103Рисунок 4.8. МС-спектры в режиме регистрации позитивных и негативных ионоврастворов сапонинов стиракса лекарственного пик (18.2 мин, М-Н=1261,М+H=1263).3) Пик со временем удерживания около 20,7 мин имеет предположительномолекулярный ион М-Н=1321 или М-Н=1274 и М+H=1299.
Предположительноданное соединение является стиракс сапонин B – где мол. м.: 1321.391 г/моль(Рисунок 4.9.).104Рисунок 4.9. МС-спектры в режиме регистрации позитивных и негативных ионоврастворов сапонинов стиракса лекарственного пик (20.7 мин, М-Н=1321).1054) Пик со временем 23,8 мин имеет предположительно молекулярный ион МН=1314 или М-Н=1360 и М+H=1339 которая может соответствовать ожидаемойструктуре для стиракс сапонин С– где мол. м.: 1353.506 г/моль (Рисунок 4.10.).Рисунок 4.10. МС-спектры в режиме регистрации позитивных и негативных ионоврастворов сапонинов стиракса лекарственного пик (23.8 мин, М-Н =1360).106Идентификациякомпонентовтакойсложнойсмесидовольнозатруднительна, поэтому было предложено исследование продуктов гидролиза вкислых и щелочных условиях.
Нами была использована следующая методикагидролиза сапонинов: приготовлены два раствора сухого экстракта стираксалекарственного с концентрацией 20 мг/мл для щелочного и кислотного гидролиза.Полученные растворы инкубировали на термошейкере при 80°С в течение 2 часовпри 1400 об/мин. Растворы центрифугировали и анализировали супернатант врежимах регистрации позитивных и негативных ионов.Хроматографический анализ с МС-детекцией показал, что в результатещелочного гидролиза исследуемого образца сапонинов стиракса наблюдаетсясложная смесь пиков со значительно меньшим временем удерживания, чем догидролиза. Среди прочих наблюдается пик со временем удерживания 6,3 мин,которыйв режиме регистрации негативных пиков имеет массу 1134,соответствующуюожидаемойструктуредезацил-жегосапонин(Deacyljegosaponin) (Рисунок 4.11.).Соединение такой структуры может образоваться из исходных сапонинов засчет гидролиза сложноэфирных связей, характерного для щелочных условийпроведенного гидролиза.
В режиме регистрации позитивных ионов пик с этим жевременем удерживания имеет спектр с ионом 1158 (M+Na=1158). Чтоподтверждает правильность идентификации продукта гидролиза (Рисунок 4.12.).Рисунок 4.11. Структура Deacyl jego saponin / Styrax sapogenin107Рисунок 4.12. МС-спектры в режиме регистрации позитивных и негативныхионов растворов щелочного гидролиза сапонинов стиракса лекарственногоВ исходной смеси до гидролиза данное соединение (со временемудерживания6,3мин)практическиотсутствует,чтоподтверждаетегообразование в ходе щелочного гидролиза.В условиях кислотного гидролиза сапонинов стиракса лекарственного наспектре ВЭЖХ также наблюдается набор пиков.
Один из пиков со временемудерживания 17,4 мин имеет спектр в режиме регистрации негативных ионовхарактерный для продукта полного гидролиза Theasapogenol B (M-Н=490,M+HCOO=535) (Рисунок 4.13.).108H3CCH3OHCH3HCH3OHOHHCH3OHHOHH3C CH3Рисунок 4.13. структура Theasapogenol BЭтот же пик имеет сложный спектр в режиме регистрации позитивныхионов,которыйможетсоответствоватьпродуктуполногоTheasapogenol B (M+Н-Н2О=473 и M+Na=514) (Рисунок 4.14.).гидролиза109Рисунок 4.14. МС-спектры в режиме регистрации позитивных и негативных ионоврастворов кислотного гидролиза сапонинов стиракса лекарственногоКомпонент с таким временем удерживания и молекулярным ионом 490 врежиме регистрации негативных ионов наблюдается в исходной смеси, но взначительно меньшей концентрации.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
