Диссертация (1141299), страница 10
Текст из файла (страница 10)
«Определение содержаниядубильных веществ в ЛРС»).Спектрофотометрическийметодиспользовалидляопределениясуммыфлавоноидов [60] в изучаемых объектах исследования. Исследование проводилина спектрофотометре «Hitachi U-1900» ulvis spectrophotometer 200V модель 3JO0003 (Hitachi High-Technologies Corporation Tokyo Japan).Спектрофотометрическое определение дубильных веществ проводили визвлечении, полученного путем экстрагирования 70% спиртом этиловым.Выполнив серию последовательных разведений, измеряли величину оптическойплотности в кювете с толщиной слоя 10 мм при длине волны от 274,5 до 277,5 нмотносительно спирта этилового 70%.
Параллельно измерили оптическуюплотность раствора стандартного образца танина [114].Для определения содержания ряда индивидуальных органических кислот, атакже для определения макроэлементов использовали метод капиллярногоэлектрофорезанаприборемарки«Капель-105/105М».Детектированиекомпонентов проводили по косвенному поглощению при длине волны 267 нм[26].57Количественное содержания пестицидов, радионуклидов и тяжелых металловосуществляли с помощью атомно-абсорбционной спектроскопии. Подготовкуобразцов и определение проводили в соответствии с НД [56 - 59], а такжеруководствуясь методическими указаниями по атомно-абсорбционным методамопределения токсичных элементов в пищевых продуктах и пищевом сырье [104].В качестве стандартных образцов в работе были использованы коммерческиедоступные индивидуальные вещества: DL-Яблочная кислота ИМП, D (-) –Фруктоза ИМП, коричная кислота Ч, кверцетин ЧДА, галловая кислота 99% PA –ACS, рутин 97%.С помощью метода ВЭЖХ исследовали состав антоцианового комплексаплодов рябины черноплодной различных сортов.
При определении профиляиндивидуальных антоцианов использовалась система ВЭЖХ «Agilent 1100» сдиодно-матричнымспектрофотометрическимдетектором(ДМД)ивремяпролетным масс-спектрометрическим детектором «Agilent 6200 series»(ВЭЖХ-МС/TOF).Неподвижная фаза: колонка Phenomenex Luna C18 250 x 4.6 мм, 5μм.Подвижная фаза: A - 1,0 %-ный водный раствор муравьиной кислоты и В ацетонитрил. Ступенчатый градиент: 0 мин - 10% В, 10 мин – 12% В, 20 мин –15% В, 30 мин – 20% В, 40 мин – 30% В, 50 мин – 40% В, 51-60 мин – 10% В.Общее время анализа 60 мин. Скорость потока подвижной фазы 0.5 мл/мин.Температура колонки 40ºС, температура автосемплера 20ºС. Объем вводимойпробы 20 мкл. Длины волн ДМД - 520 нм и 280 нм.
Спектры снимали в диапазонеот 200 до 700 нм. Условия МС: напряжение на капилляре – 3.5 кВ, поток газаосушителя (азот) – 9 л/мин, температура - 325°С, давление на распылителе – 0.27МПа, сканирование масс – в режиме регистрации положительных ионов [М]+ вдиапазоне от 100 до 1500 m/z. [112].Оценкубиологическойактивностиполученныхлекарственныхформпроводили по методике В.С. Бузламы [26]. Данный метод позволял определитьхарактер действия изучаемых объектов на клетки при воздействии на них58внешних неблагоприятных факторов.
Из нескольких имеющихся методик былвыбран «Метод разрушающего воздействия» с использованием культурыинфузорий «Paramecium caudatum».Вработебылаиспользованакультураинфузорий,содержащаявэкспоненциальной фазе не менее 2500 особей в 1 мл среды, а в стационарной фазе- не менее 7000 особей [52].Определение антиоксидантной активности полученных лекарственных формпроводили титриметрически, используя в качестве титранта 0,01 М растворперманганата калия [127].Извлечение перед определением разбавляли доисчезновения розового окрашивания.Статистическуюобработкурезультатовисследованийпроводиливсоответствии с общей фармакопейной статье ГФ XI (ГФ XIII), вып.
2, ОФС 420111-09.В исследовании использовались следующие извлечения из сырья изучаемыхсортов рябины черноплодной:1) Спиртовые извлечения () из свежесобранных и высушенных плодов аронии,полученные в соотношении 1:40 (высушенные плоды), в соотношении 1:25(свежесобранные плоды);2) Водные извлечения из высушенных плодов аронии различных сортов,полученные в соотношении сырье-экстрагент 1:10;3) Жидкий экстракт 1:1, полученный из высушенных плодов рябинычерноплодной методом перколяции, ОФС «Экстракты», настойка 1:5, полученнаяиз высушенных плодов рябины черноплодной методом дробной мацерации, ОФС«Настойки».ВЫВОДЫ К ГЛАВЕ 21.
Дана характеристика объектам исследования.2. Приведеноописаниеиспользуемогооборудования,реактивовстандартных образцов.3. Охарактеризованы использованные в работе методы исследования.и59ГЛАВА 3. ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВПЛОДОВ РЯБИНЫ ЧЕРНОПЛОДНОЙКачественные реакции на основные группы биологически активных веществпроводили по известным методикам [71,76 -78,81,85,86]. Образцы плодов аронииисследовали на присутствие: флавоноидов, антоцианов, органических кислот идубильных веществ.Дляпроведенияспиртовыекачественныхизвлеченияизреакцийобразцовготовилиплодовводныерябиныиводно-черноплодной.Для этого 2,0 г измельченного до размера частиц 1 -2 мм воздушно-сухогосырья заливали 20 мл воды очищенной и настаивали на кипящей водяной бане собратным холодильником в течение 30 мин.
Полученное водное извлечениефильтровали. Водные извлечения использовали для дубильных веществ иорганических кислот. Водно-спиртовые извлечения получали экстракциейспиртомвконцентрации70%пометодике,описаннойвНД,ииспользовали для обнаружения флавоноидов и антоцианов. Полученные данныепредставлены в табл.3.Таблица 3. Результаты определения групп биологически активных веществ вводно-спиртовых извлечениях из плодов рябины черноплодной с помощьюкачественных химических реакцийГруппа БАВФлавоноидыДубильныевеществаХимическая реакция1.Цианидиновая проба2.Реакция с 5% р-ом алюминия хлорида3.Реакция с 1% р-ом хлорида железа(III)Наблюдаемыйэффект+++4.Реакция с р-ом гидрокарбоната натрия5.Реакция с р-ом ацетата свинца1.Реакция с р-ом желатина2.Реакция с солями алкалоидов-603.Реакция с дихроматом калия+4. Реакция с р-ом ацетата свинца5.Реакция с реактивом Фолина-ДенисаАнтоциановы 1.Реакция с 10% р-ом ацетата свинца+е соединения 2.Реакция с 10% р-ом гидроксида натрия+Органические 1.
Реакция с калия перманганатом+кислоты2.Реакция с раствором йода+3.Реакция с солью железа (II)4.Реакция с раствором нитрата серебра+Ввиду того, что в химический состав плодов аронии входит большоеколичество полифенольных соединений и других классов, которые такжевзаимодействуют с возможными вещества, представленными в таблице, данныекачественные реакции не является избирательными.
Поэтому целесообразнымбыло использование для идентификации данных групп БАВ метода тонкослойнойхроматографии.3.1.Изучение антоциановых соединений плодов Рябины черноплоднойхроматографическими методами3.1.1. Изучение антоциановых соединений плодов Рябины черноплоднойметодом тонкослойной хроматографииОсновной группой БАВ, придающей плодам густую темную окраску, являютсяантоциановые соединения, поэтому на первом этапе исследований осуществиликачественныйанализименноэтойгруппывеществплодоварониисиспользованием тонкослойной хроматографии.Для качественной идентификации антоцианов в плодах аронии использовалиметодтонкослойнойхроматографиинапластинкахмарки«Sorbifil».Элюирование проводили в системе: н-бутанол- кислота уксусная ледяная – вода(4:1:1), объем нанесения пробы 10мкл.
Высота подъема фронта растворителя – 8см. Зоны антоцианов на пластине обнаруживались в виде ярко окрашенных пятен,не требующих проявления [97].представлен на рисунке 9:Общий вид полученной хроматограммы61Анализируя данные рисунка 1 можно сделать вывод о том, что нахроматограмме всех четырех образцов обнаружено по 4 зоны с окрашиванием,характерным для антоциновых соединений, (Rf= 0,43; 0,51; 0,59; 0,85).На хроматограмме извлечения из образца, заготовленного на территорииВоронежской области, наблюдается появление еще двух их 3 на рисунке пятен,имеющиххарактернуюдляантоциановыхсоединенийокраскуиненаблюдающихся у остальных анализируемых образцов (Rf=0,14; 0,27), чтосвидетельствует о различии в качественном составе антоциановых соединенийисследуемых образцов.Рис.9.Результаты ТСХ-анализа антоцианов в спиртовых извлечениях извысушенных плодов Рябины черноплодной:1- извлечение из плодов аронии, заготовленных на территории Адыгеи; 2извлечение из плодов аронии, заготовленных на территории Воронежскойобласти; 3- извлечение из плодов аронии, заготовленных на территорииАлтайского края; 4 –извлечение из плодов аронии, заготовленных на территорииКалининградской области.3.1.2.
Изучение антоциановых соединений плодов Рябины черноплоднойметодом высокоэффективной жидкостной хроматографииОдним из современных инструментальных методов, который используется длякачественного и количественного анализа минорных биологически активных62веществ растительного происхождения является высокоэффективная жидкостнаяхроматография (ВЭЖХ).Извлечение антоцианов из сырья проводили по следующей методике: к 2,0 гизмельченных плодов рябины черноплодной добавляли 20 мл воды. Экстракциюпроводили на УЗ бане при комнатной температуре в течение 15 минут.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
