Диссертация (1140950), страница 11
Текст из файла (страница 11)
8).Содержание факторов Н, I, В, D комплемента в сыворотке кровиопределяли иммуноферментным методом c использованием готовых наборов(AssayMax Human Factor B ELISA Kit, Catalog No. EF7001-1, AssayPro;SEB978Hu Enzyme-linked Immunosorbent Assay Kit For Complement Factor I,Cloud-Clone corp.; HK342 Human Complement Factor H ELISA KIT, Hycult ®biotech; HK343 Human Complement Factor D ELISA KIT, Hycult ® biotech). Дляэтого 100 мкл исследуемой сыворотки помещали в лунки готового набора.Проводили инкубацию в течение 1 часа при комнатной температуре, а затемпромывали 4 раза промывочным буфером, добавляя по 200 мкл последнего на20 с. Далее добавляли 100 мкл разбавленного конъюгата в каждую лунку иинкубировали планшет в течение 1 часа при комнатной температуре.
Вновьпроводили4-хкратнуюпромывку,азатемдобавлялипо100мклтетраметилбензидинового субстрата в каждую лунку и оставляли на 30 минутпри комнатной температуре с закрытой крышкой. Реакцию останавливали,добавляя 100 мкл готового стоп-раствора. Интерпретацию результатовпроводили в течении последующих 30 минут с использованием стандартнойпанели считывателя, следуя инструкциям производителя.57Определение удельной активности фактора Н оценивали по количествуCFН, связавшегося с С3b, считая, что только функционально активныемолекулы фактора Н могут связываться с С3b. Количество связавшегосяфактора определяли стандартной тест-системой (ELISA).
Путем делениявеличины связавшегося CFН на количество свободного CFН получали значениеудельнойактивности.Занормупринятызначения,полученныеприисследовании стандартными тест системами пула сывороток контрольнойгруппы, рассчитанные в процентах (от 70 до 130 %). Контрольную группусоставили 20 здоровых доноров (10 мужчин, 10 женщин в возрасте 22-48 лет (всреднем 30).2.5. Морфологическое исследование ткани почкиМорфологическое исследование ткани почки проведено 12 (40%) больнымс КАФС и 26 (53,1%) больным с аГУС: в 11-и случаях КАФС и 24 − аГУСисследовались почечные биоптаты, а в 2-х случаях КАФС и 2-х – аГУС –аутопсийныйматериал. Изучение почечного материала проводилось накафедре патологической анатомии (зав.
– д.м.н, проф. Е.А. Коган) проф. В.А.Варшавским и к.б.н. Е.П. Голицыной или на базе ГКБ №52 проф.,д.м.н.СтоляревичмикроскопияЕ.С.Всемпарафиновыхбольнымсрезов,выполняласьсветооптическаяиммунолюминесцентнаямикроскопиякриостатных срезов с антисыворотками к иммуноглобулинам человека А, М, Gи СЗ-фракции комплемента и иммунногистохимическое исследование сантисыворотками к фибриногену.Отсутствие морфологического исследования у части больных КАФС иаГУС связано со сложностями выполнения биопсии почки при наличиитромбоцитопении и с крайней тяжестью состояния больных.В почечной ткани оценивали: частоту и характер поражения клубочков,изменений канальцев, интерстиция и сосудов, наличие и особенностииммунныхотложений.Признакамиостройтромботическоймикроангиопатии считали обнаружение при:581.Световой микроскопии:- ишемии клубочков: отек эндотелиальных клеток, сморщенные стенкикапилляров, сегментарный мезангиолизис;-в артериолах и капиллярах: тромбоза, аневризматического расширения,пролиферации эндотелиальных клеток;-в артериях: тромбоза, отека эндотелиальных клеток, утолщения интимы склеточной пролиферацией (типа «луковичной шелухи»);-кортикального некроза2.Иммунофлуоресценции:отложенияфибринавстенкахкапилляровклубочков, артериолах, артериях; фибриновые тромбы в просвете тех жесосудов.Морфологическимипризнакамихроническойтромботическоймикроангиопатии считали следующие изменения, выявленные при световоймикроскопии:- в клубочках: увеличение мезангиального матрикса, утолщение и сморщиваниекапиллярной стенки, двуконтурность базальных мембран, сегментарныйсклероз, дольчатость клубочков;- в артериолах: сужение просвета за счет фиброзной гиперплазии интимы,гипертрофия мышечного слоя;- в артериях: фиброз интимы с сужением просвета.2.6.
Дополнительные визуализирующие методы исследованияАртериальныеивенозныетромбозыбылиподтвержденыинструментальнымиметодами.Периферическиетромбозысосудовдиагностировали методом ультразвуковой допплерографии (УЗДГ). Тромбозыкрупных и мелких артерий головного мозга были подтверждены при помощикомпьютернойилимагнитно-резонанснойтомографии.Тромбоэмболиюлегочной артерии выявляли с помощью сцинтиграфии или компьютернойтомографиилегких.Инфарктмиокардаипостинфарктныеизменения59диагностировали на основании характерных изменений на ЭКГ. Состояниеобщей сократительной способности миокарда и клапанного аппарата сердцаоценивали по данным ЭХО-КГ. Некоронарогенную ишемию выявляли спомощью сцинтиграфии миокарда с Те 99.
Тромбозы крупных и мелких артерийи вен (почечные артерии и вены, нижней полой вены, портальной и печеночнойвен) диагностировали на основании УЗДГ и/или компьютерной томографии сконтрастированием. В группе КАФС подтверждающие исследования быливыполнены 25 больным (83,3%): УЗДГ – 21 (70,0%), МСКТ/МРТ – 13 (43,3%),сцинтиграфия – 2 (6,7%). В остальных случаях тромботическое поражениеорганов было подтверждено морфологическим исследованием ткани почки(n=2; 6,7 %) или данными аутопсии (n=3; 10,0%). В группе аГУС УЗДГвыполнена 6-и пациентам (12,2%), МСКТ/МРТ – 14 (28,6%).2.7 Генетическое обследованиеМолекулярно-генетический анализ выполнен 20-и больным с аГУС (40.8%)Поиск мутаций в клинически значимой части генома человека (экзоме)проводился методом секвенирования лабораторией ООО «Генотек» по панелиаГУС: CFB, CFH, CFHR1, CFHR2, CFHR3, CFHR4, CFHR5, CFI, DGKE, THBD,MCP, C3, ADAMTS13.Полученные данные интерпретировались с использованием современныхрекомендаций общества по изучению человеческого генома (Human GenomeVariation Society)[31].
А именно:üНе рекомендуется использовать термины «мутация» и «полиморфизмы»üРекомендуется использовать термин «генетические варианты» или«изменения», а также «варианты последовательности»üНе рекомендуется использовать термин «патогенный», предлагаетсяиспользовать термин «нарушающий функцию», кодируемого белкаüДля обозначения генетических изменений, рекомендуется использоватьследующие обозначения:60«affects function» – нарушает функцию (влияет на функцию)«probably affects function» –возможно нарушает функцию«unknown» – влияние на функцию не известно«probably does not affect function»- возможно не нарушает функцию«does not affect function» - не нарушает функциюüВсе генетические варианты, для которых не определен функциональныйэффект, могут обозначаться термином "variants of unknown significance"(VUS) –варианты с неизвестным клиническим значением2.8.
Статистический анализПолученные данные подвергались статистической обработке при помощипрограммы SPSS Statistics Version 20, IBM, США. Анализ соответствия видараспределения признака закону нормального распределения проведен спомощьютестаКолмогорова-СмирноваикритерияШапиро–Уилка.Взависимости от соответствия данных нормальному распределению приописанииколичественныхданныхиспользованыследующиерасчетныепоказатели: Ме [25;75], где Me – медиана, через точку с запятой значения 25 и75 процентилей (при распределении данных, отличающихся от нормального),либо М (SD), где М – среднее арифметическое, SD (Standard deviation) –стандартное отклонение (при нормальном распределении данных).
Дляпроверки согласия наблюдаемых и ожидаемых частот вычислен критерий хиквадрат (χ2). Для выявления и оценки характера взаимодействия междуразличными факторами использовали непараметрический тест ранговойкорреляции Спирмена (rs). При проведении сравнения сформированных групппациентов для признаков, имеющих нормальное распределение, использованкритерий Стьюдента (при выполнении второго условия – равенства дисперсий,проверенного по критерию Левена). Для признаков, имеющих распределение,отличное от нормального, использовался критерий Манна–Уитни. Критическоезначение уровня статистической значимости при проверке нулевых гипотезпринималось равным 5 % (p = 0,05).
Многофакторный анализ проводился61методом бинарной логистической регрессии (метод enter и метод Forward LR).Учитывая малые группы в виду редкости заболеваний, а также пилотныйхарактер исследования, статистически значимыми считали показатели с р неболее 0,1.62ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ3.1. Клинико-лабораторная характеристика больных КАФС и аГУСОбе группы преимущественно состояли из пациентов молодого возраста (до 45лет). Однако средний возраст заболевших атипичным ГУС был достоверноменьше (p=0,019), чем возраст пациентов с катастрофическим АФС, таблица 3.Соотношение мужчин и женщин в группах несколько различалось: более 50 %пациентов аГУС составляли мужчины, среди пациентов с КАФС, напротив,преобладали женщины (таб.3).Таблица 3.Клинико-лабораторная характеристика больных КАФС и аГУСПризнакКАФС (n=30)Средний возраст, лет35,2 (±12)Пол ,n ( %)Ж-17 (56,7)М- 13 (43,3)р0,019nsаГУС (n=49)28,3 (±13)Ж – 21 (42,8)М -28 (57,2)Тромбоциты, тыс.
в мкл88,5 [57,2;172,5]0,18198 [48,5;135,0]Гемоглобин, г/л81,4(±23,4)0,06469,1 (±17,4)ЛДГ, Ед/лn=20(норма 240-480)615,0[562,5;936,5]ADAMTS -13, %n=759 [24;70]n=440,7870,035813,5[566,25;1312,25]n=2777[53;98]р – уровень статистической значимости различий; полужирным шрифтом выделеныстатистически значимые различия между группами3.1.1. Гематологические проявленияПолную характеристику МАГА удалось получить не у всех больных, всвязи с отсутствием данных об уровне ЛДГ и тромбоцитов у части больных изретроспективной группы и у некоторых пациентов, которые в момент острогоэпизода поступали в другие стационары.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
