Диссертация (1140426), страница 11
Текст из файла (страница 11)
8., рис. 9). Для кровеносных сосудов – площадь просвета,периметр и диаметр капилляров (максимальный и минимальный размерпросвета капилляров).4. Измерение площади ареала мужских половых клеток осуществляли врежиме полуавтоматического выделения объектов с помощью предложенныхв окне «выделение масок объектов» с режимами «добавления и вычитания»,что помогало решить задачу о селективности измерения исключительноплощади, приходящейся на половые клетки, сводя погрешность измерений кминимуму (рис. 10).Кроме того, подсчёт половых клеток осуществляли в пределах условногоквадрата: по латеральным поверхностям первой и последней из четырёхсперматогониев проводили две параллельные прямые, по направлению кпросвету канальца.
Определяли площадь квадрата (рис. 11).5. Для подсчёта клеток Лейдига использовали площади прямоугольника иокружности вокруг кровеносного сосуда (рис. 12).6. Использование в компьютерной программе закладки «Фильтры» помоглорешитьпроблемуколичества клетокнечёткостиизображения,затрудняющейподсчёти выделения границ исследуемых структур (площадимежканальцевой интерстициальной ткани, извитых семенных канальцев,ареалаполовыхклеток,параметровсосудистого–капиллярногокомпонента).Анализ генеративной функции яичек во всех группахО генеративной функции семенных извитых канальцев мы судили наосновании показателей диаметра и площади поперечного сечения извитыхсеменныхканальцев,индексасперматогенеза,среднегочисласперматогоний, спермацитограммы с использованием клеточного индексаСертоли, цитологического профиля сперматогенеза, количества канальцев сослущенным эпителием и числа гигантских сперматогенных клеток (если ониесть).60Рис.
8. Измерение площади межканальцевой интерстициальной ткани яичка сиспользованием программы «Видео Тест 4.0. Морфология». ИГХ, увеличение ×400(синим цветом закрашена межканальцевая интерстициальная ткань).Рис. 9. Измерение компонентов интерстициальной ткани, клеток Лейдига и кровеносныхсосудов с использованием программы «Видео Тест 4.0. Морфология». ИГХ, увеличение×400 (серым цветом закрашены извитые семенные канальцы).61Рис. 10. Измерение площади ареала половых клеток в извитых семенных канальцах яичка сиспользованием программы «Видео Тест 4.0. Морфология». ИГХ, увеличение ×400.
Краснымконтуром отмечена площадь ареала лишенная мужских половых клеток. Звёздочками отмеченыкровеносные сосуды (артерия мелкого калибра).Рис. 11. Стандарт подсчёта (50 мкм) половых клеток в извитых семенных канальцах яичка сиспользованием программы «Видео Тест 4.0. Морфология». ИГХ, увеличение ×400. Чёрнымконтуром отмечен квадрат подсчёта половых клеток. Звёздочками отмечены кровеносный сосуд(артерия мелкого калибра).62Рис. 12. Измерение площади ареала и количества клеток Лейдига с использованием программы«Видео Тест 4.0. Морфология».
ИГХ, увеличение ×400. Красными контурами отмечены областиподсчёта клеток Лейдига: пунктиром – по окружности кровеносного сосуда, сплошнойпрямоугольник – в париваскулярном регионе.2.6. Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени (ПЦР-РВ)Фрагменты биоптатов яичек были помещены в стабилизирующий растворRNAlater (QIAGEN, Нидерланды) и хранились при –70°C. Впоследствииобразцы подвергли гомогенизации согласно стандартному протоколу.Экстракцию тотальной РНК производили с использованием набора готовыхреактивовRNeasyPlusMiniKit(QIAGEN,Нидерланды).Синтезкомплементарной ДНК (кДНК) с матрицы полученной РНК осуществляли спомощью набора SuperScript™ VILO™ Master Mix (Invitrogen).
ВыделенныекДНК подверглись ПЦР-РВ с использованием готовой смеси реагентовABsolute Blue QPCR Mix (Thermo Scientific, США) с интеркалирующимфлуоресцентным красителем SYBR Green I. ПЦР-РВ проводилась сиспользованием StepOne System (Applied Biosystems, CША) и штатногопрограммногообеспечения.Анализ63экспрессиигеновпроведенсиспользованием метода определения порогового цикла (Ct) и вычисленияотносительной экспрессии генов согласно протоколу [10]. Нормирование ивнутренний контроль выполняли относительно референсного гена GAPDH.СтатистическийконтрольпроводилсяотносительноI.А.группыснормальным сперматогенезом (аналогичного возраста с бесплоднымимужчинами).Подборпраймеровбылосуществлённаоснованииобщедоступных материалов о последовательностях ДНК и мРНК генов в базеданных NCBI с использованием программы Primer-BLAST (табл. 9).Таблица 9.
Используемые праймерыГен5´-праймер3´-праймерBAKCACGGCAGAGAATGCCTATGACCCAATTGATGCCACTCTCAABAXGTCGCCCTTTTCTACTTTGCCAGTCCAGCCCAACAGCCGCTCCBCL2TCCGATCAGGAAGGCTAGAGTTTCGGTCTCCTAAAAGCAGGCBCLWTCCAGCCCAACAGCCGCTCCCAGTGGTTCCATCTCCTTGTTGGAPDHGAAGGTGAAGGTCGGAGTCAGAAGATGGTGATGGGATTTC2.7. Статистические методы и обработка данныхПолученные в результате подсчёта данные статистически обрабатывали сиспользованием компьютерной программы SPSS 7.5 for Windows statisticalsoftware package (IBM Analytics, США). При этом определяли вариационныеряды,среднююарифметическую,среднеквадратическоеотклонения,среднюю ошибку и вероятность различия. Затем оценивали соответствие/несоответствие полученных результатов нормальному распределению сприменениемкритерияКолмагорова-Смирнова.Пристатистическойобработке для оценки достоверности различий средних значений междугруппами использовались следующие непараметрические критерии: Uкритерий Манна–Уитни, Н-критерий Краскалла-Уоллеса. При отсутствиинормальногораспределенияданных64использовалинепараметрическийкритерий F.
Wilcoxon (Statistical methods for research workers) с уровнемзначимости p<0.05.Количественныеданные,полученныевходеПЦР-РВ,былипроанализированы с использованием рангового дисперсионного анализаANOVA.Литературные источники для проведённого статистического анализа:Кобзарь А. И. «Прикладная математическая статистика: для инженеров инаучных работников», 2012; Гланц С. «Медико-биологическая статистика»,1998; Стрелков Р.Б. «Статистические таблицы для экспресс-обработкиэкспериментальногорекомендации»,и1980;непараметрическихклиническогоГублерметодовЕ.В.,статистикиисследованиях», 1973.65материала:А.А.вГенкинметодические«Применениемедико-биологическихГлава IIIРЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННОГО ИССЛЕДОВАНИЯ3.1. Морфофункциональная характеристика структур яичка мужчинI.А.
группы (при нормальном сперматогенезе)Стенка извитого семенного канальца образована половыми клетками. Набазальной мембране семенных канальцев располагаются крупные, судя по размерам ядер, клетки Сертоли (сустентоциты) с неправильными и нечёткимиконтурами. В них можно видеть одно (реже несколько) ядрышек округлой формы,а также мелкодисперсное распределение хроматина (рис. 13 – 16).В базальном отсеке семенных канальцев на уровне ядер сустентоцитоврасполагаются сперматогонии. Второй ряд ядер в извитых семенных канальцахзанимают сперматоциты первого порядка, находящиеся в мейозе I, о чёмсвидетельствуют их размер и строение хроматина.
Примерно на том же уровне вканальцах находятся сперматоциты второго порядка. Сперматиды, клеткипервоначально округлой формы и небольших размеров. Хроматин этих клетокнеравномерно распределён по площади их ядер. В просвете семенных канальцеввизуализируются сперматозоиды, головки их обращенычаще в сторонуапикального полюса клеток Сертоли.Перитубулярная интерстициальная ткань представлена рыхлой неоформленнойволокнистой соединительной тканью с множеством кровеносных сосудов, вокругкоторыхгруппкамирасполагаютсяполигональныеилиокруглойформыоксифильные клетки с округлыми ядрами – клетки Лейдига. Хроматин в ядрах этихклеток образует сетеобразную структуру, на фоне которой чётко определяетсяядрышко.Цитоплазматакихклетокчастовакуолизирована.Этиклеткивырабатывают мужской половой гормон и другие биологически активныевещества.Описаннаяморфологическаякартинасоответствуетфизиологическомусперматогенезу – в большинстве семенных канальцах в изучаемом поперечномсрезе обнаружены одна, реже две (из шести) стадии сперматогенного цикла (рис.14), а также резидуальные тельца.66123Рис.
13. Яичко (группа I.A.). H&E, ×20, м.о. – 150 мкм. 1 – извитые семенные канальцы, 2 –интерстициальная ткань с клетками Лейдига, 3 – кровеносный сосуд (артерия).IIIrbIIIIVРис. 14. Яичко (группа I.A.). H&E, ×40, м.о. – 50 мкм.Сперматогония ( ), сперматоцит I ( ), сперматоцит II ( ); сперматиды ( );клетка Сертоли (ядро) ( ); клетка Лейдига ( );I – VI – этапы сперматогенеза, rb – резидуальные тельца.67Сравнительная гистология семенников человека и Rattus Wistar:интерстициальная ткань с клеткамиЛейдигаслой миоидных клетокСперматогенный пласт:4-й ярус (сперматиды)3-й ярус (сперматоциты II)2-й ярус (сперматоциты I)базальный отсек (сперматогонии)Рис.
15. Семенник Rattus Wistar, извитой семенной каналец. H&E, ×20.Рис. 16. Семенник Rattus Wistar, извитой семенной каналец. H&E, ×20.ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗПРОЛИФЕРАТИВНОЙ И АПОПТОТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИПри иммуногистохимическом исследовании проводили оценку биологическиххарактеристик мужских половых клеток в семенных канальцах, уровень ихпролиферативной активности и апоптоза, а также элементов микроокружения.68Ki-67 (белок клеточной пролиферации)Положительная нуклеарная реакция с антителами к Ki-67 отмечалась в S-фазу митозасперматогониях («+++») на II и III этапах сперматогенеза, в некоторых первичных («+») ивторичных («+») сперматоцитах и круглых сперматидах («±»). В популяциях остальныхполовых клеток различных стадий сперматогенеза, в клетках Сертоли и Лейдига, а такжев миоидных клетках экспрессии Ki-67 не обнаружено («–») (табл.
13) и (рис. 17, 18).Рис. 17. Яичко (группа I.A.), интрануклеарная реакция с Ki-67 высокой интенсивности вотдельных клетках сперматогенного эпителия (ИГХ метод, дополнительное окрашиваниегематоксилином, ×20, м.о. – 100 мкм). Сперматогония ( ), сперматоцит I ( ),сперматоцит II ( ); клетка Сертоли (ядро) ( ); клетка Лейдига ( ).Рис. 18. Яичко (группа I.A.), интрануклеарная реакция с Ki-67 высокой интенсивности внекоторых половых клетках, II стадия сперматогенеза (ИГХ метод, дополнительноеокрашивание гематоксилином, ×100, м.о. – 10 мкм). Обозначения см. рис. 17.69р53 (белок проапоптотической активности)Умеренная экспрессия р53 выявлена в сперматогониях («++»), первичныхсперматоцитах («+»), слабая – во вторичных сперматоцитах («±»).
Впопуляциях остальных половых клеток различных стадий сперматогенеза, вклетках Сертоли и Лейдига, а также в миоидных клетках экспрессии р53 необнаружено («–») (табл. 14) и (рис. 19, 20).клетка Сертоли (ядро)сперматогониясперматоцит Iсперматоцит IIРис. 19. Яичко (группа I.A.), интрануклеарная реакция с р53 средней интенсивности вотдельных клетках сперматогенного эпителия (ИГХ метод, дополнительноеокрашивание гематоксилином, ×40, м.о. – 50 мкм).Вcl-2 (маркёр антиапоптотической активности)Иммуномечение белка Вcl-2 отмечали во вторичных сперматоцитах(«+++»), сперматидах («++»), первичных сперматоцитах («+»), а также вединичных сперматогониях («±»). В сперматозоидах, в клетках Сертоли, атакже в миоидных клетках экспрессии Bcl-2 не обнаружено («–»).Обнаружена положительная реакция на Bcl-2 в цитоплазме некоторых клетокЛейдига, расположенных ближе к семенным канальцам (табл.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
