Диссертация (1139568), страница 31
Текст из файла (страница 31)
Иммуногистохимическая реакцияс использованием моноклональных антител к Ki-67 (clone SP6). III опытнаягруппа. Увеличение ×600183При введении раствора ацетата свинца наблюдался противоположныйэффект. Так, в IV опытной группе, животные которой получали раствор данногосоединения, выявлено статистически значимое снижение ИП эпителиоцитовкожи, в 1,4 раза, по сравнению с показателем контрольной группы. Результатыотдельныхисследований,выполненныхнапримерекультурыклеток,обрабатываемых соединениями свинца [255, 377], также свидетельствовали обингибированииклеточнойпролиферации,что,возможно,обусловленонарушением белкового синтеза [377].Введение мышам II опытной группы раствора сульфата никеля и хелаторажелеза (дефероксамина) мышам V опытной группы значимого влияния напролиферативную активность кератиноцитов не оказало (рисунок 69). Этовозможно, как вследствие недостаточной кумулятивной дозы вводимых веществ,так и объективного отсутствияих влияниянапроцесспролиферациикератиноцитов.Рисунок 69 – Кожа спины мыши, получавшей раствор сульфат никеля.
Ki-67позитивные клетки в покровном эпителии и наружном корневом влагалищеволосяного фолликула. II опытная группа. Иммуногистохимическая реакцияс применением моноклональных антител к Ki-67 (clone SP6). Увеличение×600184В настоящем исследовании установлено, что воздействие солей тяжелыхметалловихелаторовэссенциальных металловприводяткизменениюапоптотической активности эпителиальных клеток кожи экспериментальныхживотных всех опытных групп за исключением I и V опытных групп, животныекоторых соответственно получали раствор сульфата цинка (рисунок 70) идефероксамин.
В коже мышей данных групп показатели ИА кератиноцитов неотличались от таковых в контрольной группе (таблица 29).Рисунок 70 – Кожа спины мыши, получавшей раствор сульфата цинка.Каспаза-3-позитивные клетки в матриксе волосяного фолликула. I опытнаягруппа. Иммуногистохимическая реакция с применением моноклональныхантител к каспазе-3. Увеличение ×600Показано, что результатом введения мышам III опытной группы бихроматанатрия явилось увеличение ИА кератиноцитов в 1,7 раза, что было статистическизначимым по сравнению с аналогичным показателем контрольной группы(рисунок 71).185Рисунок 71 – Кожа спины мыши, получавшей раствор бихромат натрия.Каспаза-3-позитивные клетки в матриксе волосяного фолликула.
IIIопытнаягруппа.Иммуногистохимическаяреакциясприменениеммоноклональных антител к каспазе-3. Увеличение ×600При интоксикации животных II опытной группы раствором сульфата никелябыло выявлено, что ИА кератиноцитов в этой группе статистически значимо, в1,65 раза, превышал аналогичный показатель в контрольной группе. Введениеживотным IV опытной группы ацетата свинца привело к значимому увеличениюпоказателя ИА кератиноцитов в 1,6 раза по сравнению с показателем контрольнойгруппой. Выявленное в настоящем исследовании увеличение ИА кератиноцитовпри введении сульфата никеля, бихромата натрия и ацетата свинца согласуется сданными работ ряда авторов, показавших сходные результаты на примереэпителиальных клеток других органов [291, 350, 417, 474]. Возможно, апоптозявляется способом устранения клеток с поврежденной соединениями токсичныхметаллов ДНК [111, 240].Введение экспериментальным животным VI опытной группы хелатора меди(ТТМ) привело к статистически значимому увеличению ИА в 1,4 раза посравнению с показателем в контрольной группе.
Это противоречило результатамисследования Bustos R.I. et al. (2013), которые сообщили об отсутствии влияния186дефицита меди на запрограммированную клеточную гибель [217]. Однако умышей линии C57BL/6 анаген ассоциирован с меланогенезом, которыйсопровождаетсяклеточнымокислительнымстрессом[349],и,вероятно,увеличивает потребности меланоцитов в синтезе антиоксидантов, таких какCu/Zn-супероксиддисмутаза, где основным кофактором, обусловливающим ееантиоксидантную роль является медь [432].Воздействие ТПЭН на мышей VII опытной группы, привело к увеличениюпоказателя ИА (рисунок 72) в эпителиальных клетках их кожи в 1,46 раза посравнению с аналогичным показателем контрольной группы, что былостатистически значимым.Рисунок 72 – Кожа спины мыши, получавшей ТПЭН. Каспаза-3-позитивныеклеткивматриксеволосяногофолликула.VIIопытнаягруппа.Иммуногистохимическая реакция с применением моноклональных антителк каспазе-3. Увеличение ×600187Полученные данные согласуются с результатами исследования Chai F.
et al.(2000), выполненного на линии эпителиальных клеток человека [354], при этомактивация апоптоза, может явиться следствием снижения внутриклеточнойконцентрации цинка с последующим повреждением митохондрий, активациейкаспаз, в первую очередь, эффекторной каспазы-3 [354, 604], а также истощениемглутатиона и окислительно-восстановительным стрессом [227].Количественной мерой различий пролиферативной и апоптотическойактивности кератиноцитов мышей контрольной и опытных групп явилосьевклидово расстояние (ЕР), рассчитанное с учетом показателей ИП и ИА.
Нарисунке 73 расположение групп определялось нормализованными показателямиИП, отмеченными на оси ординат, и ИА, отмеченными на оси абсцисс.Рисунок 73 – Евклидово расстояние между контрольной и опытнымигруппами188Чем больше евклидово расстояние между группами, тем существеннейразличия между ними по исследуемым показателям. Так, наиболее удаленной отконтрольной группы была I опытная группа, животные которой получали растворсульфатацинка,ЕРмеждуданнымигруппамисоставило2,58.Этосвидетельствует о том, что наибольшее воздействие на анализируемые клеточныепроцессы оказывало введение сульфата цинка, в основном за счет выраженногоувеличения пролиферативной активности (ИП I опытной группы на 83,86% вышеаналогичного показателя контрольной группы). Обратило на себя вниманиенесоответствиевыявленногоуровняпролиферативнойактивностиморфологическим изменениям на светооптическом уровне.
Выше описано, чтопри интоксикации раствором сульфатом цинка, каких-либо структурныхизменений в коже мышей, получавших данный препарат, не было, в то же времяименно при воздействии раствора сульфата цинка был зарегистрированмаксимальный индекс пролиферации и установлены наибольшие отличия отконтрольной группы по данным расчета ЕР.Наиболее близко к контрольной группе была расположена V опытнаягруппа (ЕР=0,79), получавшая дефероксамин, поскольку введение хелаторажелезанеизменилопролиферативнойиапоптотическойактивностикератиноцитов у экспериментальных животных данной опытной группы.Отмечено, что на почти равном удалении от контрольной группы находились IIопытная группа, мыши которой получали раствор сульфата никеля, и IV опытнаягруппа, животным которой вводили ацетат свинца, ЕР составило 2,18 и 2,17соответственно.
Однако вводимые растворы сульфата никеля и ацетата свинцаоказывали одинаковое влияние лишь на апоптоз, что выражалось увеличениемИА соответственно на 65,6% и 62,5% по сравнению с аналогичным показателемконтрольной группы. При этом введение раствора ацетата свинца снижалопролиферативную активность кератиноцитов (ИП IV опытной группы на 29,3%был меньше, чем в контрольной группе), в то время как интоксикация растворомсульфата никеля не оказывала влияния на данный показатель.
Равноудаленнымиот контрольной группы также оказались VII опытная группа, животным которой189вводили ТПЭН и VI опытная группа, животные которой получали хелатор меди(ТТМ). Евклидовы расстояния между контрольной группой и VII опытнойгруппой составило 1,72, а между контрольной группой и VI опытной группой –1,70.
Данные препараты индуцировали апоптоз кератиноцитов. Так, показателиИА эпителиальных клеток кожи мышей VII и VI опытных групп были выше посравнению с аналогичным показателем контрольной группы на 45,62% и 40,62%соответственно. Однако ТПЭН и ТТМ оказывали противоположное влияние напролиферативную активность кератиноцитов. Если введение ТТМ приводило кснижению пролиферативной активности в исследуемом материале (ИП на 39,5%меньше, чем показатель в контрольной группе), то воздействие ТПЭН, напротив,увеличивало пролиферацию эпителиальных клеток кожи (ИП выше, чемпоказатель в контрольной группе на 33,76%).
Следовательно, одинаковыйрезультирующийэффектвоздействиятяжелыхметалловихелаторовэссенциальных металлов, выражающийся одинаковым удалением опытных группот контрольной, является следствием разнонаправленного влияния действующихвеществ на процессы пролиферации и апоптоза кератиноцитов. Евклидоворасстояние между контрольной группой и III опытной группой, животныекоторой получали раствор бихромата натрия составило 2,42, что объяснялосьувеличением пролиферативной и апоптотической активности кератиноцитов кожимышей, которой получали данное соединение.Вцеляхклассификациивводимыхвеществпоихвлияниюнапролиферативную и апоптотическую активность кератиноцитов мышей былпроведен кластерный анализ, в основе которого лежали данные ИП и ИАкератиноцитов животных опытных и контрольной групп.
В разделение накластеры внесли вклад как показатель ИП (F=85,9; p<0,001), так и показатель ИА(F=8,7; p=0,005). Данные показатели в кластерах и контрольной группестатистическизначиморазличалисьмеждусобой:дляпризнака,характеризующего ИП, р<0,001, для признака, характеризующего ИА, p=0,0004.Анализ данных, приведенных в таблице 30, показал, что 1-й кластер,объединяющий три группы экспериментальных животных, получавших ацетат190свинца, дефероксамин и ТТМ, характеризовались низким по сравнению сконтрольной группой ИП, который в 1,37 раза был ниже, чем в контроле, приэтом различий по ИА установлено не было.Таблица 30 – Индексы пролиферации и апоптоза для кластеров иконтрольной группыКластеры/группа1-й кластерИндексы пролиферации, %Индексы апопотоза, %М±m95% ДИp-уровеньМ±m95% ДИp-уровень7,35±0,36,7 – 8,010,0004*4,0±0,323,32 – 4,70,170,00008*4,97±0,164,64 – 5,30,0001**–3,2±0,222,67 – 3,73–2-й кластер14,05±0,57 12,86 – 15,25Контрольная10,1±0,339,39 – 10,95группаПримечение.
* - различия с индексом пролиферации контрольной группы; ** - различия синдексом апоптоза контрольной группыВо 2-м кластере, объединившем четыре группы экспериментальныхживотных, получавших сульфат цинка, сульфат никеля, бихромат натрия и ТПЭН,индексы пролиферации и апоптоза превысили значения аналогичных показателейконтрольной группы, соответственно в 1,39 раза и в 1,55 раза. Возможно, чтоувеличениепролиферативнойактивностикератиноцитов,являетсякомпенсаторной реакцией в ответ на активацию апоптотической гибелиэпителиальных клеток кожи. Графически описанные различия отражены на6,0185,516Индекс пролиферации (%)Индекс апоптоза (%)рисунке 74.5,04,54,03,53,0141210862,52,0123СреднееСреднее±Ст.ош.Среднее±Ст.откл.4123СреднееСреднее±Ст.ош.Среднее±Ст.откл.Рисунок 74 – Диаграммы размаха показателей индекса пролиферации ииндекса апоптоза в кластерах (1, 2) и контрольной группе (3)191Глава 6.