Lenindzher Основы биохимии т.1 (1128695), страница 32
Текст из файла (страница 32)
Оба этих метода основаны на различиях в кислотно-основных свойствах аминокислот, т.е.на различиях в знаке и величине суммарного электрического заряда при данном значении рН, которые можно легко предсказать исходя из величин рК' и кривых титрования исследуемых аминокислот. 124 ЧАСТЬ 1, БИОМОЛЕКУЛЫ 5.17. Злектрофорез на бумаге позволяет разделять аминокислоты в соответствии с их электрическим зарядом Простейшим методом разделения аминокислот служит э еекгнрофореэ на булгаге (рис.
5-13). Каплю водного раствора, содержащего смесь аминокислот, наносят на полоску фильтровальной бума- ! и, смоченную буфером с двинь!м значением рН. Дш!ее к этой полоске прикладывают высокое напряжение, создаюшее сильное электрическое поле. Из-за различий в величинах рК' аминокислоты перемещаются вдоль полоски в том или Полоска фильтро. Пнтно, содерьаыте вальной бумаги сл!есь аминокислот Катод Анод Рис Ь! 3. Разделение аминокислот методом злсктрофореза на бумаге. На полоску бумаги наносят каплю раствора, соэыржашего смесь аминокислот.
Ей дают высохнуть, после чего эту полоску бумаги смачивают буфером с заданным зна кинем рН и помешают между охлшкдаюшими пластинами Концы полоски погружают в кюветы с электродами и включают высокое напряжение. В возникающем при этом постоянном электрическом поле аминокислоты разделяются а соответствии с их суммарным электрическим зарядом при выбранном рН.
Аминокислоты, которые при этом значении рН представляют собой катионы, мигрируют я катоду (отрипателыюму полюсу), а аминокислоты. имеивцие форму анионов, перемешаются к виолу (положительному гюлюсу), как это показано на схеме, изображающей электрофореграмму в момент времени Т,. В «оннс процесса (на схеме в момент времени Тэ) бумагу высушивают, опрыскивают линг идрином и нагревают, в результате чего на бумаге преступают пятна, соответствуьэшие расположению различных ами- нокислот,которыеможно идентифицировать луг ем сравнения их положения с положением аутентичных аминокислот, используемых в «ачествс есвидетелей». ином направлении и с разными скоростями в зависимости от рН буферной системы и приложенного напряжения.
Например, при рН 1,0 гистндин, аргинин и лизин несут зарзш + 2 и движутся к отрицательно заряженному катоду быстрее остальных аминокислот, заряд которых равен +1. Сдругой стороны, при рН 6,0 положительно заряженные аминокислоты (лизин, аргиннн и гистидин) движутся к катоду, а отрицательно заряженные (аспарагиновая и глугаминовая кислоты) — к аноду. Все остальные аминокислоты либо остаются на месте их нанесения, либо перемещаются лишь на незначительные расстояния, так как кроме ог-амина!руппы и а-карбоксильной группы у них нет других ионизируемых групп; поэтому изозлектрические точки всех этих аминокислот практически не различаются. Об этом свидетельствуют величины рК,' и рК,', приведенные в табл. 5-4. Чтобы установить положение разделенных аминокислот на электрафореграмме, полоску бумаги высушивают, опрыскивают нингидрином (см.
ниже) и нагревают. Синие или лиловые пятна, проступающие на бумаге, указывают на присутствие той или иной аминокислоты. При тех же условиях проводят электрофорез известных образцов аминокислот, которые служат <!маркерами», позволяюшими определить характерное для каждой аминокислоты положение на электрафареграмме (см. рис. 5-13). 5. 18. Ионообмеинав хроматография служит более эффективным способом разделения аминокислот Для разделения смесей аминокислот, а также для идентификации и количественного определения разделенных аминокислот особенно широко применяется метод ионообменной хроматографии. Этот метод тоже основан на различиях кислотно-аснбвных свойств аминокислот, но большой вклад в его эффективность вносят некоторые дополнительные факторы. Хроматографическая колонка представляет собой длинную стеклянную 325 гл.
5. дминокислоты и пбптиды ший положительный заряд (лизин, аргннин и гистилин), особенно активно вытесняют ионы Ха' и вследствие этого очень прочно связываются со смолой. Аминокислоты, несущие при рН 3,0 наименьший положительный заряд (глутаминовая и аспарагиновая кислоты), связываются со смолой в наименьшей степени. Все лругие аминокислоты несут в этих условиях промежуточный по величине положительный заряд и характеризуются соответственно промежуточной прочностью связывания со смолой.
В результате различные аминокислоты продвигаются вниз по колонке со смолой с разными скоростями, которые зависят в основном от величин их ртС, но отчасти Аниогьюяе центры Обмен БО, Мв квтигмов )йнз — ~нй — СО~ 5О, Нв* также и от их способности адсорбироваться на частицах смолы или растворяться внутри них. Глутаминовая и аспарагиновая кислоты будут проходи.гь через колонку с наибольшими скоростями, так как прн рН 3,0 они связываются со смолой слабее всех других аминокислот, тогда как лизин, аргинин и гистидин будут двигаться медленнее остальных аминокислот.
Выходящий из нижнего конца колонки раствор (элюат) собирают в виде небольших порций (фракций) объемом по нескольку миллилитров каждая и определяют количества содержащихся в них аминокислот. Весь этот процесс сейчас полностью автоматизирован, так что отдельные его стадии — элюированне, сбор фракций, их анализ и запись данных анализа — осуществляются по заданной программе в специальном приборе-аминокислоигиом анализаторе. На рис.
5И5 показана хроматограмма проанализированной таким способом смеси аминокислот. трубку, заполненную гранулами синтетической смолы, содержащей прочно связанные с ней заряженные группы. Смолы со связанными анионными группами назьгваются катиоььооблгеннылги, а смолы со связанными катионными группами — аиионопбмеииылш. В наиболее простом варианте ионообменной хроматографии разделение аминокислот осуществляньт на колонке с катианообменной смолой, в которой связанные анионные группы, например остатки сульфоновой кислоты ( — ЯОэ ), сначала «нагружают» ионами )ь)а' (рис. 5-14). Затем на поверхность смолы наносят кислый раствор (рН 3,0), содержащий анализируемую смесь аминокислот, Рис.
5-ге. Ряэличные ионные формы кятио- нообменной смолы. Отрицательно элряженные сульфогруппы ( — $О, ) притягиеяют и свяэы- ияют хвтионьс например Н, Ня, или ке- тионные группы еминокислат. При рН 3 боль- шинство яминокислот неходятся я форме кятио- ноя, котя и различаются ло величине суммарно- го положительного заряда и, следсвктельно, по способности вытеснять ионы Не ', связанные с фиксироеяииымн книонными группями.
Осе. бенно орочно связывается лизин, содержлпмй лес ьыи -группы,янаименее прочно- глуге- миноевя и еспярягинояея кислоты, которые при рН 3 несут ненменылий положительный зярял. Не сеюыеяние кминокислот ионообменными смолами влияет тлкже их способность цдсорби- ровяться ня чкстипвх смелы и ркстворяться вну- три этих честна и медленно пропускают его через колонку. При рН 3,0 аминокислоты представляют собой в основном катионы, несущие суммарный положительный зарял, но различающиеся по степени ионизации. По мере прохождения смеси через колонку положительно заряженные аминокислоты вытесняют ионы )ч)а+, связанные с группами — ЯО,, которые прочно присоединены к частичкам смолы.
Аминокислоты, имеющие при рН 3,0 наиболь- ь бо ННь СНЦ вЂ” ОЗОН + 2Нв цО-, ЙНз — 04К-СООН 126 ЧАСТЬ !. БИОМОЛЕКУЛЫ а — — пи 4,25 Колонка еысстса 155 си ри3,25 .........- — --- ! 0,2 и. ел рте ишриг Коленка иысстой 15 см и 5,25 0,55 и. нитрат натрия Метиоюи Изг трс,„ни "" Р - 1Сгр.н г г.асам !изин 1,0 0,5 б 0.3 0,1 320 ЗЗО 370 410 450 490 50 90 130 1жат, ил О С Он н С + К вЂ” С вЂ” СООН Аыинокислота с'' 1Ч~~ Игшгнлрин Н нн СС~ +к — С О О с ОН !! < 1 О О но с !! О Нингидрнн О О Пурпурный пигмент Рис.
5-16. Нингилринопая реакпии.используе- мая лли обнаружения и количсстиеннога опреле- лення содержания и-аминокислот. Атомы амп- нокис готы указаны красным ггаетам, ч ю позао- ляе г следить за их судьбой и холе реаинии. В конечнолг счете и составе лилаиого пигмента ох азы аагагся г гас молекулы нингидрина и а юм азота аминокислоты. 120 150 200 240 250 Рис 5-15. Аитоматнчесьая регисграпнирезуль- тш он хроыатографи некого рамслсиня амино- кислот на кнтианоабмепиои смоле. Элюирояа- ннс аминокислот пропилят различными буфера- ми с посгспенна иозраг таюш ими значениями рН. Выкадишин из мшапки растиор собирала небольшими порпиямн я отдельные пробирки, после чег о я каждой из них аптомати иски опре- лелиется садержание амннакисхаты.
Плошадь пол иажльаи пиком пропарггиаггжтьгга количе- стпу соотаетсг ауюшей аминокислоты и анализи- руемой смеси. 5.1у. Хизинческие реакции, характерные дли аминокислот Способность аминокислот, как и всех других органических соединений, вступать в химические реакции определяется наличием в их составе функциональных групп 1см. гл. 3). Поскольку все аминокислоты содержат аминогруппу и карбоксильную группу, каждая из них может вступать в химические реакции, характерные для этих групп. Например, аминогруппы могут быль ацетилированы, а карбоксильные группы — этерифицированы.
Мы не будем рассматривать здесь все органические химические реакции„ н которых способны участвовать аминокислоты, но отметим лишь две важные реакции, широко применяемые для обнаружения, идентификации и количественного анатиза аминокислот. Первая из них-это ггингидриновия реакция (рис. 5-1бй используемая для обнаружения и точного определения небольших количеств аминокислот. При нагревании аминокислот с избытком нин! ид- 0,2 к.
нитрат катрях — — ~ О О 1 !! с с ! С=дй — С ~ -ЗН,О е Н с с 1 127 глэх аминокислоты и пкптиды НОа 1-4ггор-2,4-линнтро- бенэол 5.20. Пептиды — зто цепочки аминокислот р Н ! 7Ч-:-Н ! Н вЂ” С вЂ” К О-Аыннокнслпга ! СООН ЫОИ 2,4-линитрофе- нилаыиноино- лата ! Н вЂ” С вЂ” К ! СООН Рнс.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
