Ю.А. Овчинников - Биоорганическая химия (1128694), страница 72
Текст из файла (страница 72)
Эффективность проникновения зкэогенной ДНК е клетку низка. Для плазмид типа рВК322 можно получить 1йь — 1О' трансформантоа пр» добавлении ! мкг ила»миды к обработанным Сас!г клеткам, т. е. из «аждь к ! О' — !О" плазмид в клетки попадает только одна. Поэтому среди бактерий, полверпникся трансформации, только небольша» часть оказь вается Ну«лви ов э слог . е в О «,(пт! гын Днн' пр»л Рнн Дг с ДГН Ццзц(ШШ"'"' р .(шс» » к ш дик" итхз трансформ раввинов. Отделение ее от об!цен массы аыполниетсв в процессе клонирования (см.
с. 372!. Операция заключаетси а посеве бактериальной суспеизин определенной концентрации иа твердую питательную среду. например нв агар с питательными добав. качи в чашке Остри таким образом, чтобы на ! см' позер«носи приызднлось 5 -- (Р бактерий. Бактериальная клетка, попввшав на поверхность агар«, начинает делитьс», и в конечном счсге в точке локализапии обрээуетса семейство ее пптоыкав в виде мажнькой «олош и, по вншииему виду похожей на шляпку !риба Эта колония называется клоном (рис. 25! !. Кашлев клетка исходной суспенэии образует свой «лои, все клетки коз орого имеют свойства бектеринродонэчальникв (нозгпиаиаа колония). Вс и э качестве вектора слу нт олазмида рВВ322, та длв отбора бактерий-трансформантоа.используют добавление в питател ный агар антибиотика ампициллина илн тетради лина„в загмснмостн от тоге.
«акой нз генов, ЬЬ или !е(, остался нщвктиым после введения чужероднон ДНК. Нв таком среде шюиы обрвзуэж тол о етки с плазм дами. Для отделения ре«омбинантных бактерий часть материала «ал лого «лона переносится нв другую чашку Петри, содержащую антибиотик, геи устойчивости к «оторому был разрушв» прн создании рекомбинантоа На атон чашке Остри дают кломы только те бактерии, юпорые содержат исходную плазмилу рВВ322, а рекомбинвнтиме бактерии «лоны ие образуют. Н еле такой идентификации рекомбинвнтныс клоны могут прнменгпься для дальнейшего анализа. Отбор по определенному биоло и е ому признаку, в частности по устойчивости к антибношку, называется селсксжен. у»и«э« и жакерия Ф бр 41 ф1 н.
но «о ОО р и «ое,«г .с р э .сг а«. ше ше э Клонирован е при исполш анни в качестве ае торов бакте. рнофэ а й осушсс »лается сзмлуюшнм образом: к суспензни бактерий, обработ» нмх СаС1 . лоб»ил»ется ДНК Раш н осуществляется посев на ча «у Петри с питательным агэром так, чтобы иа ! см' поверхности попадало У-- 1О клеток с щюникшей в ннх ДНК фага, Клеши, не салержагцие ДНК фага, рвам ожвются на шаре и дают мугныи ровнмй газоне, заполннющнй асю поверхность чашки.
Однако в тек тачках, «уда попали бактерии с ДНК фага, остаю си орозрвчные круглыс просвеп . называемые блвш«ами или негативными колониями Образование бляпжк связано с тем, гпз ДНК фага реплицируетс» в кштке и лшт зрелые фагоаыс частном. 3«тем фаговме частицы попадают в среду, заражают окрузкаюшнс «леткн и разру ают ил.
В результате кажда» бляшка состоит из потомков фатов, сод«ржаных одну гз гу же ДНК вЂ” копию ДНК, попавшей в «летку. Фаги типа М13 не дают негативных колонии, поскольку онн не разрушают летки. Олнаио в месте их размножения кштки Н соб замегыяют деление, что при«ндпг к о явлению на обшем мутном газоне более прозрачных бляшек. Способы селекции осизааиы либо н» том, что в иесущественнуго область фага (МП1 вводя ген, п1юграммирующ«й устойчивость к антибиотикам и разрушаюпшйся прн внедрении исто чужеродной ДНК, либо на рзхшчнн цветных реакций, дешемых «летками, зарем«иннин исходным и рекомбинаитиым фатимы.
Полу мине ДНК ю~е клошгрошггия. ДНК лл» «ланигюшння мает быть пелучена хнмико-фермситативимм си тсзом. обратиои Ну лв о,г слог Проблемы экспрессии ч)гжеродныд генов Прн вклкгченни бактернальных . снов вместе с их регуляторнмми участками в Е. соц он», «ак правило, экспреесирунпсв, данса мРНК и белок. Это происходит гютому, то в сигнальных гюследавательностяк, управляюишх транскрипцией и трансляцией в разлнч ык прокарнотических ор анизмвх, мно о общего.
Однако экспрессии ю ов эуквриот в бактериях иаблкщается очень редко, если не созлаввть специальные условия. Регуляторные сигналы ау«ар»от сильно отлмчаются от регулнторных сигналов бактерий транс рипцней мРНК или пут м непосредственного расщепления геномнай ДНК нужной рестрикционной эндону махой. Прн обратно» транскрипции вукариотической ыРНК чаше всего используется тот факт, что на ее 3"-конце обычно содержится по и(А)-послслоютелы«ютц благоларл которой в кэ естае ютрав«и цл» обратной транс риппии можно применить о иго(дТ). На первой стадии обратив» транс риптаза синтезирует одноцепочечную ДНК, комплементарную мРНК.
Эта ДНК обычно садерлгит на 3' конце «шпильку . После удалении РНК обработкой шепа ью игы РНКээами обраэуема» оцноцепочечиэ» ДНК слупят затравкой.матрицей цлл фрагмента Кленова ДНК-полимер«вы !. который при наличии четырек дНТР дгктраиваст вторую цепь. В результате образуется ошилечна» структура, превращаема» в истинную деулцспочечнУю кДНК обР»уму«ой боя)члеазай <Рис. 252). Даэве поаучениую «ДНК можно встроить в соотаетстауюшин шкто)г с помощью линкеров или оннекторной техники. Идентификация юклюа.
Если вставка содер кит юиы, способ. ные к эк.прессии в новом козин»с, рекомбииантные клоны мечут быть идентифицированы по сиитезируемому ими прову« у. Однако чаще приходится идентифицировать непосредственно нук иотидную вставку, для чего нспользукгг методы гибридизации. Бвктериалыше (илн фасо»не) колонии выращи»аниса на нитроцслжолозны фильтрах, помещеннык на чашку Петри с питательной средой (рис, 253). После этого пригатавлнваютс» так называемые репли кн - к фильтру с исходными «олониямн прил»мается свежий нитроцеллюлознмн фильтр, «оторый затем переносится на чашку Петри с и юг»ой питательной средои, где на ием образуютса «о, лопни, идентичные первым Диме фильтр реплику пощмргают гце очной обработке, клетки в колониях подвергаются лизи роев пню, н денвтурироваи не и ДН К нз клеток связывается с нитропеллюлозой в том месте.
где бмла распологкена соответствующая колонии. Если а распоряжении исследователя имеетсл радиоактивная <" Р- нлн " 1-меченнал) ДНК или РНК, комплементари*я требуезюй встав е, то при выдергкн«энии фильтр» в растворе, содержащем радиоактивный полинук ле гид, посщдиии гибридизуетс» с комплемеигвриымн последовательностями. В результате те части фильтра, в «отормх находились рекомбииантные клоны с требуемой вставкой, оказыеаюгс» радиоактивными и идентифицируются рсдноавтографически.
Радгюактивные «пробы по у ают химичес им синтезом (в тех случаях, «огда извести» последовательность не«омон вставки или белка. котор й она «однрует), выделением индивидуальных или сильно обогащенных мРНК с послецуюшим их иовнуоаан ем 'гч1. а та«же фермент»тинным синтезом соотаечствующнх «ДНК с использованием ь Р-мечсимк дезоксирнбомуклсозндтрнфосфатон. )ви вк же вр 'с -чГ„.—, к —, Ос( тсй сп тсд с л рвкзю ИН Ыв( А( ИНу Ст -(у -А Р( с вр» РЬ тр НО-Ст -5 тл -РЬ*.)Ъ Р-С (-фра» т ЦН А)а Гйт-Су -(ть-Ас РЬ 5 РЬ т р ЫО.Ст -5 -ТЬ -РЬ*-ть н не узнвютсз бактеривлынлми РНК-полимерззвми и рибос мами.
Прн клоиирова ии не кДНК, в теиомной ДНК зуквриотичесвой клетки экспрессия ие происходит, поскольку в бактериальной клетке отсутствует система «сила»сингам Поэтому цая осуществления экспрессии зуквриоти еского кена соответствуюшаз кДНК или сннтети»еска» ДНК, содержащая кодирующую последовательность, присоепиннетсз в составе векторной молекулм к регуляторным элементам ба торин "иром тору и рибосом-саятываклцему участку. Иносдв присоединение зедетс» таким образом, что «одирующан част зукарнотического сена присоединветсн к коднрующей асти бактеривльносо щнв тэк, пабы сохранялась рамка счнтыивния.
В последнем случае образуются гибридные белки, содержащие в Н-концевои части бакюриальнын белок или есо часть, а в С-концовок части .. эукариотнческий белов. П(ммерам использования та«ото способа акспрессн» явлнется получение сормана соматоссатина в «летках Е. соц ( К. Итакурв„ П Винер) (см. с. 2бу). Аминокислот»а» последовательность сормана известна, и искодв из нее, согласна щнетмчес ому коду, была выведена структура соот. нет "твуюшего искусстве»носа щиа. Осуществлен его синтез: тен содержал на Н-конце коде АТО, «одируюи(ий метионин, и липкий щ ц от с у ш й ра шелл нн ре риюззой е. зн ААКП а на С-конце -- два стоп-кодона (рнс.
254). Этш фрагмент ДНК бмл присоединен к фрвсменту щнв б-тала тозидазы Е. соз„солер1кашему в С-коицевэн части участок рзснмплеиия Есой!, и вместе со своим промотором и оператором бмл встроен э нлазмнду рВВ322. В результате такого соелинени» получен тнбрнднмй ген, в котором С-концевая часть гена ()ивлвктазищзм заменена сеном» сомвто. ствтииа. Между сеном ()-салэктозндазы н собственно юном сомвтостасина находится «одом метнаиииа. Тра»с«ряпина н транскяци» этою п~брнда осуществлялась за счет использоаани» соответстаую~цих сигнальных послсдовательи стен Р-щлактозидазы. В результате обрвзовалсн химерный бел к, а котором сомвтастатин отделен от б-галактазидазнои части остатком метионмнв. Поскольку соматостачнн нс содержит метнониновых остатков, то при расщеплении химерило белка бромцианом соматостатни был отделен в виРе целого пентина. Такои спо об экспрессии испол зуетс, «огда возможно отцсепщнне зкспрессируемсно пеотида от М-к нцевой части «имерного белка или «огла достаточно по учить пгбрндный голипептнл, например в случае полу енн» искусственных вакцин, глс достата но пали и необхал.ммх антигеииых детерминаи .
Пу«ле оаы «л гы йцйн~~ 55ля получении белкой солерыаших более 150 аминокислот, чащ. попользуется прямая зксоршсия соответствующих генов. в результате «оторой сразу сннгезируютсв требуемые белки лишь с незшчительиой мовифи ацней. При этом кадирук щвя часть ген» соединяется с бактериальным промотором. рнбюсомсаязыщ«гщям участкгн и нницнируюшнм кодаком АТС (рис« 255> Именна таким образом получены штанцы Е. сой, прелуцируюш р р а, ерф ро к дру белки, имеющие большое практичщко» значение Присоединение к копирующей части гене иницинруюшего колона необходимо щ~ обеспече и» и ициации трвнсляц и. Это ирна дит к тому. ю Н-кциц эав часть сиитеэируемых таким соособом полкпептидов отличается от природиьш прис>тсгвием Н-юг»целого формилметиоиииа.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
