Ю.А. Овчинников - Биоорганическая химия (1128694), страница 71
Текст из файла (страница 71)
сомы, рибосоми передви~зется по мРНК на один триплст и в Аиазнре оказыааетси слслующ й «одон мРНК, Рибосома готош «ерисм) си лу ш Д и ш.- РНК. Тр и л ь ш» к т из«руотси фв тором Вр -С. Пооц сом с у т л е т сОг ТЕрд(мнйг(мй Нг Наконец, последния стадии — тсрминация осуществляется, ко гдв рибосоми достигает терминирующего ко)юна — САА, НАС или НСА, которнй окэзмвеется в А-центре.
В этой ситуации к рибосоме Пе д Р З(3 Г н 4 приспедиинстс» один нз Вд-факторов, в реэулвтате чего проискодит гидролиз сложноэфирпой связи, соединяющей пплипептид и тРНК. От пептндил-тРНК етшеплнетси готовая белковая цепь, неэар»- :кеннея тРНК покидает рибосому, и процесс трансляции завершается (рис. 243). Генная инженерия Генная инжсги:рия, или текника уекомбннвитимх ДНК,— это совокупность приемов. позволиющих путем операций ш (Гго перенести генетический материал из ол)юго организма (которнй принято назмвать источником гегюв) в другой (назмваеммй хозиииом или рециписнтом) таким образом, чтобм обеспечить наследоввн тих генов ~юво дл них рг ни м . Перенос шипа методами генной инженерии даст юзможность преодолеють межвидовь~с барьерм и паредаватыпдельнис наслелстаеннме признаки опник организмов другим (например, от человека или кивотного— бикт рии и т.
п.). В гчююй иигкеиерин широко спользуются под. холм и метолм бноорганической химии. В самом общем вале принцип генной инженерии изпбрагке» на рисун е 244. В какой-либо из заранее емлелеиимк реплнконов козвинв вводят ~п тяго иужнмй ген из дружно источника. Полученную таким образом рекомбниантную молекулу, сохранвюшую свойства реплнкопа, снова еислрают в клетку-хавкина, в которой он буцет реплицнроваться и стабильно передаввтьсн «лсткам по томкам прн делении. Длн реализации зпм идеи требустсн соответствующий репликон, «оторыд может легко выдслнтьсн, сохранять свои свойства в сжжобея «нсдряться в клетку после ввслеанэ в мего чужеродной ДНК и, нвкснен, стебнльно наследоюмжз.
Рспликоны, прсднззнкченныс для заслонив чужеродных ДНК в клетки, гюзываются векторами. д распоряжении исследователи лонжин быть способы соединения исхалнык генов с вектором н вмжеин» рекомбинантиых репки коала в клетку-хозяине. Необходима также уметь отличить летки, содерлющнс рскомбинантныд репликон, от искодиых реципнеитных клеток. Пгсл» ввсдени» иулнюго тема в рецнпиекиеую клетку задачи в зависимости от поставленной пели могут быть резличнымн. Иногда о«азывастся достаточным омыто внедрить чужеродный генетиче- Гв а жеарк скин материал, в более саалгном случае требуетси осуществить еш экспрессию в иовом казвина.
Методы решении всех этих задач невесаобрезио рассмотреть на примере наиболее ха>юшо изученного ренипиента — ишечнаи палочки Е. соб. Нукав новые с ат Способы соединения фрагментов ДНК, используемые в генной инженерии Многие решрикиноииые зпаапукшаэы, >нсшеплли ДНК дакт липкие птицы 1см. с. 353) типа Есор1. Ни~ОН!, ВагпН!, бвН, Рн! и др. Нри расщеплении адгюн и тои аш рестриктазад рвзличимк ДНК обрат>ютси одинаковые липкие канны и полученные фр..м аы с* д г друг друп а н о на дни нп а (р с. 245>. Различные ДНК могут быть соединены при помощи ДНК-лигазы и па гулим концам.
Дли обеспечены» возмолаюсти расщеплении рекомбинэитных ДНК по е твм соединении «ектар» и вставки испальзуютсв чакме с д« днк. .~5- "=- Р' у . А т с с 1 А О О с А А 5' 3' ф~!~!ф Вбдбфа . 5' ! С Л ЛГВР М Е б Он табл ц 15 ЪЧИЧ Г МРХГМ . б Г Г Р ИМЕ ХУ В В ГЕИМИ Р "ГП' ! ААА ААА ! ТТ) С!САТС С с стас)с АИ«П1 и Н) ЛС)СТ тс )сл А)САТС Т Т СТАС)Л А!ц 1 й«!. П СО(СС СС !Сс с!ААТ г с С ГТЛА!С Нын) Е К) Отт 1слс САА1СГС С Т А(АОСТ Т Т ГССА! А Н ))И Ныс И Стуу(О ЛС САРИ РуТС С)ГО С с сс)с Нр И Н1пб П СГТ)ААС СЛЛ!ТГС С'ГАС ! С С)СЕТС С Нр 1 Кр 1 С ТСС*)с С(ЛССТ С СС(СС СС!ОС Р П С)ТСС* С с лсст)с сАс )стс О(С!СЛС Л 1.1 !Чх П ССС)ССС ОСОГССС Т)СС А А СС)Т йни) т«1 см:циальные при» н. ьинболее раси)х«транеиным иэ «спорых «властев метов ли» еров (см с.
377). Нсрелко применвстсв «и«нектар«ли пливкв получения рскомбииантиых ДНК Она эаключа«тси в том, что с поманив «онце ой нуклеотилилтрвисфсрахы (см. с. 35!) к 3'-концу одного фрагмента присселнниегсв гомополинуклеотиц например полн(ПТ) или поли(бс), а к )Оконцу цруюго фрагмента -. полииуклеотнд, «Омплементврпый гюпользусмому в первом случае, т. е.
полн(ОА) нли поли (46) (рис. 249). При добавлении фрагментов др)т к другу они комплсксуютс» за счет образования комплсмсгмарн х паросиований между «опцсаыми щмополниуклеогидами„а щтсм соелиииютс» в клетке-хозяине с помощью сс ферменгвтиенощ аппарата. Мукле оаые к с оп. Векторы, испольэуемые в Е. соВ— плазмиды и бактериофаги 2 ОП ) 4961 Н О и) 999 , )42» а . )47, П л сивых Ь а (224» Молекула вектора должн» отвечать опрецслеииым требов югямг быть иебольщой, содержать уннквлыгые участки расщеплен»» рестрик цнонпы ми эндонуклеа замп, иметь маркеры для оптимальной селекции рекомбпнанпцах «летои. В капотне.векторов для включении чужеродной ДНК в клетки Е. сой иыюльзуютс» щмзмиды (т рмин предложен лж.
ледербергом) и бактерищрагн. и те и другие нвллютсн рспликснами. Многие плазмиды, представляющие собой двухцепочечные кольце»не молекулы ДН»й содержат гены, которые придают содержащим их бактериям некоторые фсиотипичсскн«прививки, такие, как устойчивость к антибиотикам, солям тюкелых мствллО» н т. д. Если основнае бактериальиая ДНК имеет ллнну около 5 !О" и. ат то размеры плазмид соси!ваяют всего несколько тысяч пар оснований Онн легко вмцеляются н очищаютсв.
Специально аконструн(ювзнм векторные плазмиды. позволяющие отмгчеть «летки. садергкащне рекомбннантные молекулы, ат исходных бактериальных «леток. В «в«естес примера нв рисуи- Н !й й !1 Рэопюе В,Н! Н !И РН йаащб!В3 щ»Вубн»» Фре ме«ДНН с г В«пН 1 ! Р и В Н1 РН В 11 Вп пН 1 Нс:л РВНЗ2 Хр окм Е ой Трэмлыпмю Е, а« ~~=:)~~ ©(~~=ф Нел и щп и ае лса РВПЗЗЭ г е Юе «ере сыа» Ю егм'лса те юг «пюеек те и Р 1«КС ц г мрипеемт песец е и Ююг с чу»эра»«ым фрагментам ДНК„та в полученной рекомбииантнай ма»скула астанстс» нетронутым только пщ Ыа, а ген (е( утрачивает свою активность, поскольку ега ласледоэателаность разрмваетс» ке 247 приведена плазмида РВВ322, она содергкит два тема, программирующие уатойчиммть к двум разлмчнь«ч амщбиотнкам— тстрацнклину (ген мц и вмпнцнллнну (ген Ыау. В геи» ю1 находите» уник»лью«е учщтки расщепления растр»«газани Нюд!П, ВащН1 и Баб, а е гене ЬЬ вЂ” участок расщепления Рвй.
Если разрезать олазмнду любой нз рсстриктаз, участок расщепления которой находится в гене !е1, н соединить ее методом лмпкнх концов )И е озые « о имм,мшээцмрмфам уэгм;шм еммршещйшк к г г м э к' й г вставкой. Наоборот, прм разрезании плазмидм рестриктазои РМ) и висдреини в этот участок фрагмента ДНК инактивируетсл ген Ыа, тогда «ак ген ге) продел:кает обеспечивать синтез белке, при да ющепэ Е.
сод устойчивость к тетрацмклииу. Использощиие такой методо. лопги оозволщт быстро идентифицировать клетки, содержащие рекомбинаитиые паазмгшы. Приискание подобного приема показало иа рисунке 2ЯВ. Расшеплеиие исходной плазмиды рВК322 по сайту ВашН) последующее лигмроваиие с фрагмеитом ДНК приводит к смеси исхолиых и рекомбииаитимх плазмид.
При введении этой смеси в Е сой сбразуютсв «летки трех типов ие содержащие плазмилу, содержа цие исходную рйй322 и клетки с рек мбииант. мои плазмидой Их легко отли ить по раэл» мои устойчивости н антибиотикам. Диелизирусмую ДНК Кожно д ть и в другие репюгкоиы, способные раэмиожвтьсл в клетках Е, соб, например в б тер офаг и.
Из миожестщ известных фетов чаще всего в «кеес ве еектороа используют скоиструироваииме производны фа е ! и фатов М(3 и йй болыяое раз гюбразие векторое существует иа основе ба«триофвга )„в иих используется особенность фага, состоящая в том, что эиачительиая часть его ДНК ие нужна длэ размио» енин фаге в «летке (рис. 2еч). Это позволяет вводи ь чужеродную днк в ДНК фага ). при испольэоваиии его в «вчеств: вектора, причем длина вставляемого фрагмента мажет быть существенно болыэс эеличниь фрагмеитв. встраиваемое о в плазм ду. йа;кную группу екторов„в~кроко используемых при уста«аз ленни первичной структуры ДНК, соствелв«м митевидиые бактерио.
фаги, такие, «ак М)3 Ы и П шаг М)3 представляет собой одноцепочечиую цм л ческ)ю ДНК длиной около 6И)0 кукле идов. После ииф цироваи я бвкчериал ной «щеки одно жпочечиа» ДНК фа а превращается в цвухцепочечную репликативиую форму (йр). и прая ва всех отношениях подобие плаэмиле.
Кроме того, фэговая ПНК содергкит ко(юткий учв ток (560 яуклеатидав), названный межгеииой последовательностью [МП), несущественный для ее гкизиеспособи к.тм (рис. 2Ю). Таким образом, выделив рецликативиукг форму Д Н К и расгдепие ее в области иесугцестнеиною участка. мо;кмо с помощью лигаэы вставить в место разрыва чужеродиук ДНК. Введение рекомби наигиой двукцепоче иой молекулы в клетку Е сай приводит к е репликвции.
синтезу 1б )-цепи, упаковке последне» в белковый чокал н выделе ию фага а срепу. Далее инфицированная нте видным фетом клетка, продолжая делитьс», юмя и с замедлеинон скоростью, постепенно выделяет в окру» ающую срс)О большое количество фага. Этот фвг содержит в вирионе одноцепаче иую циклическую ДНК, в которую встроена одна из цепей чужеродной РНК Трансформация, трансфекция, клонирование и селекция Процесс введения плазмнды в «летку, вызмваквций наследственные изменение в ней.
называется рол форлач г'. Процесс инфекции клеток с помощью чужероднык ДНК, приводящий к образованию зрелого фатовато потомства, на»навете» гр ясфг Чи и'. Практически наиболее общин способ трансбюрмации и трансбюкцни основан »атом, что при обработке клеток бактерий Сас1г нх мембрана становится проинцаемой длл ДНК.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
