Ю.А. Овчинников - Биоорганическая химия (1128694), страница 73
Текст из файла (страница 73)
Ферме«ты продессииг» бактериальипц «летки чвстичио удаляют ее. одиако часть сиитезируемого белка все же сохраияет модифи ацию. В м огих слу аяк таки модиф «аци» ие мекает физиолосичес их своисгв продукт», ио при получении лекарствсииых препар тов иеобх димо У«»тыва~ аозможкый ее эффект. Нлектибгикаци» экспрессируюших рекомбииацтиых клопов. Метод идеитификации э«спрессирующих «лои в зависит от саоиств продукта зкспресси».
Если этот продукт обладает собствеииой био логичсс ой актив остью, то ои молгет быть »де»тиф«пиром» по ее првввлеиию. Например, если экспрессии подщргастся тек «одируюпщй фермент. то «лоим идеитифицируют по иэличию в иих соотеетстэующеи ферме»тат»в«ой активжзстм; «лоиы, сиитезцрующие иитерфсрои, - па противовирусиой вщ:ив»ости клеточиь х экстрактов и т. д. Одна наиболее бшими являются методы иммуиохимическога аив.
иза. ир меиимые как в случае прямой экспрессии, так и при синтезе гибридных белков. Существует миого вар«вигов иммуиохимическасо впал»за. Од»и из и»»более распрострвиеикмх за тючаетсв а следующем. На лгс е з . р лв рб рук с и еч и аитите а к исследуемому бел у Кало»пи прямо ги чашке Петри лизируются в миг« х условия», и полиэииилхлорищэ й диск июдигсв в ко»такт с по срхиостью чагц и. Продукты с аитигеииыми детермииаигами пекод»ого белка образуют омплексм аитигеи — аититело с вити. телами, сорбироваииыми иа ди хе только в местах поло» ения зкспрсссирующих «лоиок Затем диск отмьиюется от иссвецифи.
чес и сорбироэаииога аитиг ив и обрабатываетея раствором с мечеииыми (радиоактивио, флуоресцеитио илв иммуиофермеигно> аищтегими. Эти вититела образуют омпкюкс с «из»геком аа счет его друц(х вщ геииых детермииаиг, в результате чего участки диска. садерлщшие первьй юмплекс а»циси - аититела, оказыэаютса мечевыми (рис. Зуб). По пологкеиию мечеиых участков иа диске лег к идеитифицироват зкспрессирующие «слои»и. Клонирование в различных организмах В иа таящее время рэзработвиы систем ало«яр авил» в различиых бактериях. дрож»мх, гр бэ, растеииях и млекопитающик.
Наиболыпий питерсе с практической то ки з(жии» представляют системы «лоиирова г(ж ительиых бактериях, мьогие из которых пал»юге» иром эшлеиио испол зусмыми, а также в дрожжах и кщтках высших оргаиизмов. Обык»о ве торы цля лоиироааи к в таких системах пргдсшэлкюг собои двоииые репликоиы. «отарме могут существовать и в Е. сод, и в той щитке «озэиие. цля которой аки пред«вял»челы. Это достигэстс» созда»»ем гибридиьп ее«юров, содер*.каших реп. лико« вк к-либ из плачмид Е. соц и требуемый рспп»кои, иа. пример ил»амиды В. шбщп или дрежжеи, что позволяет Шюэолить первоначальна» «по»ирои»«ив и отбор требуемых геиов в хорошо изучеииой системе Е сой, а затем уже вв эчть выделеииые рекомбииа тиме олазмиды в иовый оргэиизм.
Тэ ие векторы должки содержать в себе геи или гены, придающие клетке-хозя»«у легко тестируемый признак, например устоичмаость к аитибиотикам. Клонирование в грычположительных бактерияк. Наиболее нгироко используюгсн методы «лои»1юеанна а В. и Ы11~« н стрел пм«- цстах. Разработка систем векторов для В. «оЬЬ1ь основана на способности и»взмыл Бгврьуьжоссш ачгеох. иесущах гены устоичи вести к антибиотика«. я рспликапии и стабильмому наследованию в сенной палочке.
Длв этих целен гибриды таких ила»жид с плазмидамн Е. соэ гннроко используются в «ачестве векторов двл В. «оЬЫя. Рек б е штамм ут признак усшичнвости к антибиотикам. Стрепшмицеты широко при еияюгся з биотех ологии в качестве продуцентов внтнбмотикоа. Конструирование векторов для кло нирошн я в ник началось с выделения плазмнды Бср2 из Б1шргошусез соеЬсо1ог. На гмно е этой и и лобных плазмид в эстоншее рема сконструированы еекторм. придающие стрептомицетам устойч вост« например. к таким антибиотикам, ак метиленомн цнн А. Клонирование в прождав.
Наиболее широко испол зуются штаммы Бассцагошусю сегетжые. Работа с дрожжами афамчжпся тем, то. подоб о бактериям, онн могут расти а жилкои среде и давать колонии нв тв:рдои, генетически хорошо охарактеризованы и имеют сравнительно короткое ерема шиерац и. Б. сеггтЬюе гмрэз нлу Б р!.пр д в шу с б й ц 1 е у у длн ой 2 мкм. Ее гибрмды с плазмилами Е. сой обычно н исполь.
зуюг в «а ест е вектороп Селекция щюж:кевь х к юнов, трвисфармирощниых такими рекомбинентными плазмидами, основана на применении в «вчесгве «леток-хозвев определенных мутантов, не способных расти иа среде, лишенном кв ого-либо пнтателыющ компонента. Векторнаа плазмида, в свою о средь, с держит ген мли гены, которые при попадании э клетку придазп ей этот недостающии признак. Трансформа»ты легко отбираются по их способности лазать «опонии нв обедненнои ср ле. Поскольку дрожжи представляют собой зуквриогическнй организм, мо «ио было бм ожилать, что гены различных зукариаг, в том числе и те, которые содергк*т иитроны, буцут корректно экспрессиуюваться в»роз з еаых клетю к.
Однако это не тзк. Например. экспрессия генов 1В-злобина кролика в дрожжах ие происходит благодер» некорректности трвнскрмпции и последующего «сплайсингв РНК. Тем не менее, примени» приемы, аналоги ные использощвшимся при «лоиирозании в бактериях. удается достичь синтеза чужеродных белков е дро:кжевых клетках. Такие клетки, подобно В. я Ырфгд секретируюг значительное оличество белков еа виеклеточную среду, что используют такхш для секр ции чулсеродиых бе»- ков. Сагой целью х эг спресснруемому гену прнсоелиняетс» участок, «олируюший сигналы~ый пептил, обуслоаливакхции се рецню и отщеплшмый в ее процессе.
В результате в «летке синтезируется белит солергкашнй нв Н-конце сигнальный пептил. Этот б лок секретнруется в окружающую среду, Таким образом были полученьь например, штэммы дрожжей, секретирующие мнгерферои челаееюг, Клонирование в «легка» животных. Проблема к онированн» в хлеткак жижыных имеет большое значение дла исследования функшгонир вани юнов высшнк зукэрнот. Предварительно лонироавиные гены вводят а «летку животных различными путими. Один нз путей включает в себя каи-трансформацию клеток требуемым геном. соеаннениым с одним из генов, Пл» которых осуществляете» селекция.
Примером являются «летки мыши, дефектные по синтезу тимидинкиназы 1ТК -«леткиу. Клетки трансформируются фрагментами ДНК вируса шрпшв 1НБУ), содержащею щи тими.. динкин«вы, и после трансформации приобретают способность к синтезу фермента, т. е. становятс» ТК ' -«вепгами. Клет и ТК легко птлнчеютси аг ТК, поскольку они способны расти на срелах с ам- ноптериисм <блокируюгцим спрюелениые стадии биссинтезп нуклеотидов), гипоксантнном и тимидииом. Сюдовительио, при конструировзнии котрансформирующих векторе ллн трансформации клеток л нвотных нспользуютсн мб. риды бактериальнмх плазмид с геном ТК из вируса герпеса.
Пред. варительно «лоиироваиие и иделт«фи«виня генов про одятси в кжпиах Е. сок и затем рекомбииаитщи ила»мида вводится ТК -«пеки. Среди образовавши«си ТК * .трзнсформантоа отбирвютси нужные, например путем идентификации працуктов экспрещи клонироеаннык генов„ Другой путь «эсдеки» клонирошнных генов в эуквриотические «четки енвлопгчеи приме«немому е случае К соб, когда в качестве векторов используют бактериофаги.
В качестве таин« эукариотичсских векторов служат некоторые вирусы. Во мистик из них сущее «уют области ллп литичес ого роста, кдторые могут быть заменены на чугкеродиме ДНК. Такие вирусы рспп«пиру«пса в клетке-козин«с, экспрессиру» чуягероциые гены. Однако в «прусак животных размеры несунпствеииык областей мали и ие позгюляют югецрить большие фрапгвнты ДНК, Неиоторме гены гкнжпимк имека большие рзчмеры (гмпример, ген дигидрофолатредуктазы мыши — 42 тыс п.
о.). В большнистее случаев чужероди и ДНК «ще )щсв«ы, ( зу чег р бш ыс вирусы теряют способность к репликации. Дл» ее обеспечении используют вирусы-помощники, синтезирующие продукты нелостаюшик генов. В присутствии помощни ов рекомбинвнтиый вирус существует за сч т этик прггвуктов. Примером вирусац применяемых в ачеетве еектарое, «вляется вирус ВУ-40, геном которого представляет собой цнклическую ДНК л,тиной 5243 н. о. с «олиост ю известной последоввтел нытьго.
Зукаристические векторы. испсльзуюшие вирусы, снгюсбные формировать аирионы, сбладают тем недостатком, что они убивают клетку.хозяина при своем рвзмиогкснии (та лге вк и бактерисфаси). Поэтому постоянно пелаютсе попытка разработать вектпры, подобные плачмидвм. Обычно опухо. левые вирусы, в том числе и 5У-40, внедряют сваю ДНК в хромосому клетки-хозиннв. Однако вирус бычьей папилломм в трансформированных клетках существует в вице эписомы (вколо !00 копий на клетку) и используетсн е ьлчестее основы длн соацвния эписомимх векторов. Высокии темп исслелований генной инженерии нв кл ткак животных аселнет иац пкду, 'то в ближайшее време будут разработаин простые системы, «оторые позволит осуществить анализ механизмов экспрессии генов эукарнст и дкиут возможность создать жиаотиык. обладающих заданными свсистевми.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
