Ю.А. Овчинников - Биоорганическая химия (1128694), страница 63
Текст из файла (страница 63)
Далее структурный ген интерферона человека о, был присоединен к синютнческим участкам ДНК, контролирующим зксп(мс<ню генов в Е.спб (среднестатистический бактериальиый промотор, оператор (ас-вперена Е.со(г и участок сввэыаання рибосомьй. Все зто «месте составляет фрагмент ДНК величиной свыше ООО п.о., что «ел»ется настоящему времени олиой иэ самых длинных синтетических последовательностей ДНК. Нуг юа г с юты Химическая модификация нуклеиновых кислот Нуклеиновые «пехоты — пол»функционал ные соединены», соаермаш»е (юльшае !неко реакцно» оспе сбнык групп.
При дейст«»и разли ных химнческил реагентов а иих могут модифицироватьс» !юе компоненты. гетер«циклические основ»ни», углеводные остатки и остатки фасбюрной кислоты. Реа«цнонная способность мшюмернмх структур в сот~вес полимера в значительной степени изменяется цод елн»пнем пространст синих факторов. Наибпльшее значение имеют методы селективной модификации, ши(юко применяемые лри исследовании первичной и нространстеенной структуры нуклеиновых кислот, ««еленин искусственных мутаций и «зучении связи мшкду строением и биологичесной функцией. Модификация гетероциклических оснований Гетероциклическне ос»о«вима оп(пленяют сп цнфнческне своиста» нуклеиновых «ислот.
Их р экционноспособность по опюшс. нию к различным агентам зависит от ар»роды основания, условий происдени» реакции, в лля пмгго- и пол»ну«пептидов — вторичной структуры саотиегстгцюшегп соединения. реакции пнрнмидииавых оснований с бисульфнтом митрия. Бнсульфит-ион способен обратимо присоединяться к С(5!-- Об)- двойным связям нито«ива. урацилв и тимина а мягких условиях, образуя спответствуюшни алдукт, неустой иаыи в слу юе тимина; практическое зиа ение имеют .юлько реакции с урацилом н цито»ином. Продукты присоса»ненни к урацилу и цитознну довольно стабильны а «ейг(ма «ой ц кислой средах, но пеон»лают б»с!лафит.-ипи в щелочной ср..е..
Важнын свойством у,б-дигнлропронэводнын цитозииа указав. ного типа яаляетсн повышенная реакцноииоспособ юсть аминощуппы, которая лыко эамжцвет«и по«дейст«ием различных нуклеофильнык агентов. Замещение вмниогруппы на гндроксигруппу прнгюднт к производному урацила, коюрое легко прекращается э урвцил при слвбоосновныз значениях рН.
Таким образом, эта реакция дает воэможность сгпцнфн ескопг пр образования цитоэнновых колец а урацильные. Х "с« дф ец у е овы«ют нэоз гм Э,о-до ен во .б- ! реакция бнсульфита с олмоцепоче ными нукленновымн кислотами протекает э«а«июль«о меряенпее, чем с мономерами, н првкти секи не идет с двухцепоче ными молекулами. Модифи ации нукюиновых кислот бисульфнгом часто используетсн «ак способ введении мутационных замен.
С этой целию участок ДНК, выбранный дл» ввслснмя мутаций, превращаки е олноцспачечиый и затем пбрабатьижют бисул5жтом е условиях неполного дсзаминнрзваиин. Таким образом, например, пэры О С могут быль заменены на пары д-Т (такие замены называются трвнзициямид Специфичность к вторичипй структуре исполщуется также для анализа пространственного строения полинуклеотидо». Так, обработка тРНК бисулгфитом приводит к моднф «внии только цнтоэиновых щноеаинй, находящихся в петлях. рсжпщн с гидразицом и гидрокснламищхч. Гид«эхин, «го «лкнльные и ацильные проиэволные, в также гидро«си«вини и его О-влкильные ороизводные широко црименнются а иссЛедоеаииях нуклеиновых кис от. В жгдиых растворах прн кислых значениях рН эти реагснты специфнчсс«и взаимодействуют с производными цнтозиив.
МН вЂ” Ой' мн — мы — д ын„ М ~ Нмрмн-К Нукл киевы к ело ы х н,л~ь,л, и н л~к О сы н О й к — мн — С вЂ” мык В случае гидразина и его прпизволлых наблюдается лишь зэ. мешен«с аминогруппы, тогда «ак оронзвошще гидрокснламинэ оциоврсменно прнсседивяютсн по к«айной связи. образу» аддукт. В щелочных условн«к рмкции с гидразином и поцюксиламином приводит и расщеплению гетероцнклическцк «олец п римидин (с .. В25), «ракт ескн не ютрагиаая пурннокых осиоиаиий. Рсекп н ДНК с гидрвзином, сопрокождающаяси расщеплением по пиримидннаеым звеньям, нспользуетса при определении иуклеотмдной последовательности ДНК в методе Ма«сама -- Гилберта.
При анализе первичной структуры нуклеиновых к слог для сггецибмческого расшеплеиик но урацильным или цнтозиноеым заеньям мох«"г быль использована также и реакнин с гилроисмлэмином а щело иой среде. Окисление. Реакции с О«Оо широко применяемая а органик«- скоп химии дл» гнлроксилнроаения двойных связей, гладко проживет и в случае пир имнли позы« оснований. Сиоросп ргзкции возраст»- ет е раду ф: П ) С, зэк, тимндин реэгмруег почтм не юм поряцкэ быстрее ш тил на и в !й раз быстрее урн«ила.
Поэтому е» можно рассматривать «ак специфический меюд модификации тимидина При взаимодействии тимиднна с ОтО, образуется никли ы«ий эфир осмнеепй кислоты, которыи лег«а гндролизуетсе ло диолэ, а гюследиий пгщ де»станем щело и прееращаетсн в замешенную моче»»ну. Если молификапии попвергзютсл деншурнроввнные полнлеэоксинуклеот ды, то обработка «осле рещпин целщаю созлаег возможност их специфического расщеплении по тимилино. еым звеньям. Диольные соединения обраауются при взанмодействни пирнмндииовых оснований и с такими окислителлми, как КМпОь НгО». Однако в атом случае быстро происходит разрушение цикла. Реакпнл с ОгО, может использоваться лля установления поло- жени» тимндиновых звенье» прн опреиелении первичной структуры ДНК ие оном Ма сама .
Гилберта. Галогеннровлине. Одним из расоростравенных методов моанфи«ации оснований в нуклеиновых кислотах я»лавут» галогеиирование. Реакция протекает ралли но в волиык и беэвпдных средах. Нвибо ее активные галогенирующие агенты — хлор н брон. При бронировании (илн «лорнровании) производных иуклвлиевмх нислот е водных невмлочных срелах происхолнт прнссединеиие гало- гена по С(5)" С(6) двойнои св»зн «олец циримюв)на ц разрушение гуаиина.
Лдеиозин в этих услоимях с гвлогеиамн ие реагмрует. С првктнческои точки зрении важна реакция иоднроеании иук.. леиновых «полог в водим« растворах. При действии (г нли ) -ионов е р у сг и р к рн а (7(С),) иа олно мю е ные ДНК преимушествемно иолируетсе цитозин, образуя 5-иодопроизводные. При реакции с РНК наряду с 5-иодцитозином образуетс» 5-иода-о.гидро«с»-5 6.дигилрэурацнл. Пр» использовании радиюактиииога " 1 удветс» получит мечевые полииуклеоцщы с высо. к й удельной активностью, которые применяются в опытах по гибрид хапни. В без одных растворителя«под деист»нем СЬ, Вг, или соптвстствующих Н-галогенимидов щюисходнт влектрофнльное ламе ценив водорода у атомов С(5) пнримиднновык оснований и С(В) гувнина с образованием пютеетстнующих галогенпроиз водных.
Этн соединении используютс» в хв естес сгбстрато» РНК- н ДНК-полнмераз лл» синтеза специфически меченных пали»у«меч»дон. й(еркурмрощние. Широко распрострвненнаи в органической химии реакция непредельных соединений с ацетатем ртути в случае нуклеиновых кислот рокодит в мягких условиях (»од», РН 6,0-.7,0, 307 Х н ч с ея од Ф»еч у е нс»ых сто в,(мто) О ) й дв;о люю вою 40 — 50 С) и специфична по отношению «пиримнлиноюзм основа- ниям. Резуля»том реакции является образование пронзводнык 5-вцетокснмеркуриоурецила и 5-вцстоксимеркуриоцнтозниа.
Му е озые лоты 5-Неркуриопронзводные вслелствие легкого обмена атоме ртути на атомы галогена или трите» мспользуются дл» получен н сгнцифнчески меченных пиримипмиоеЫх асиошвий нуклеиновых кислот. Алки.пгроиание. Реакции алкилнроеаиия имеют большое значение дли изучения иуклеиноных кислот. С одной стороны, многие влкилируюшие реагтнты «еляютсн мутегенами н канцерогенвми, а с другои стороны, реакции алкнлировання, осушествлнемме е мяг. ких условиях, широко ислользуютси дяя исследования структуры и фунхции полннуклеотидов. Наиболее хорошо мзучеио «звнмодействие нуклеиновых «полог и нх кемппиентоа с днметилсульфатом (СНз),ВОе Зта реакции прыскает е мягких условиях а воКныа растворах.
Напра ен е реакции алкилнршмния определкется орнродой гетероцнкли»ескпга осиовармн и успениями эксперимента. Гуэни. новое кольцо в иейтралыюй среде алкнлируетсе пренмушесткенно по атому М[7), а е шелочной — ца атому М()). Исчерпываюшее метилировзнне прнволит к (,7-лиметилгуанину. В аденине и его ггроимюлных все три атома азота мшут подеергатьсе мстилироеаеию, олнако скорост реакции убышет в ряду М(! ) >М(7) > М(3). Единственным продуктом метилнро ание цитозине является З-метнлцитознн. В ДНК метилированию оолеергаются «томы М(3) аленигю. вы«плащ«в в малую борозшу В.формы ДНК, и в большей степени атомы М(7) гуанина, еыхоевшие в бел шую бороздку.
Основания двухцеп чечнык ДНК, метилироеанные по атомам М(3) и М(7), пропоюкают обраюеы ать комплемснтарные пары, но зффектненость их взаимоаействи» понижается. 7.шетилгуанни н 3-метиладении легко опцспляются от полиппюксирнбонуклеатнд юй цепи в рсзуп тате разрыаа М.гликозиднмх святей. Палее полинуклеотидиан цепь монет быть легко расщеплена по молифнцироеанному звену действием Шегючи нли анино» (см. с. 322). Такой метод деградации исппльзуеше длн определения послелоеательнссти ДНК (локалитзцн» гуанмновых и аденииовых звеньев по метопу Ма«сама — Гилберта), Реакции с «арбоднимидом.
Вл» исследования ьторичнои структуры нукленновьм кислот применяется реакция оснований производными кврболиимида, в результате щ торой образуются соот«вествующие а«ау«ты, Х«чес е» мод ф ац и у ленновмх нис от НН и'-м-.с-м-п' О~ Н .М й ~ ~3 й .. ио «г««е й'.н=с=м- й' „лн с п~ «пе и л НСОС Не "-.Х'.3 — - — .б О Н СеОСО ОСОСем ОН ОН Реа«цни с аль«твидами. Реакция амингирупп гстероциклических оснований ну«лен«нных к слет с формальлегмлом привозит к образованию амина е ол им соединениях Слелует подчеркнуть, С наибольшей скорое ю м дифнциру ся редкие «» номенты нуклеиновых «испат — ннозин п псевлоуриднн. Реакция с карбодиимидам практически не пает с лвухиепочечными полинуклеотидами.
В нуклеииовык кислотах, солермащих «ак двухпепочсчные, так и олиоцепоче ные участки, модифицируются только последние, что испол зуттси при исследованиях нюркиной структуры тРНК. йцнлнрпванне. В реакцию ацилщхимния пол действием ангидридов н галоюнангидрилов орщнических «аслот вступают как «мино- и иминогруппы, так и гищюкснльные тру п» угле«один« н фосфатных остатков. Например, при тгействии щ ц тидин бензонлхгюрида и безводном пир«дни» при НВО 'С обраэуетси пентаацилмроааиное гггюизмздное. В мигкнк щелочных услаеиях избирательно снимаютсз бензоил ные группы, связанные с гндротсильными группами углевода и в ампм Н(ЗК но сокранкется бензоилымя |рупие у зкиюмклического вто а азота что реакция обрвтнмаг при удалении формальдегнде из реакционной смеси и да «е при се разбавленнн наблюлаетсн быстрая регшьра.
цня не холиых п раду«ток В щелочной среде мстилольное спел«не»не через щюмежуточгю образуюшееся основан»» Шиффа может реагировать с э«зон«клич«ской амнногруппой пругого нушюознпа, дава» стабильное бнсннуклеозидил!метнленоаое производное Нукпвиновые к споты к — оо г лючг Широко примен»ется реакция оснований нуквенноюгх «испат с о-дикарбонил ными соединениями, такш»и. «ак пшоксвл Авгнин н Шпозин ари зюм дают »ми«ометплольиые производные, а гувнин образует трициилнческий продукт з» счет «онденсации амина- и иминогрупп с обеими карбонильными группами глиоксалн О исо ., й~ — '-4~~О Н Н Реакция нуклеиновых «»слог с тяпа«салем может рас мэтр»- ватьс» как спецнфическв« по отношению к гуаниноаым зкеньямГ скоросгь ее взвимодейстана с одноценоче ними псаинукпеот лам» значитсж но выюе, чем с даухцепочечнымн.
Она применялас при изучении первичной структурм рНК квк и~лад ограничения действе» гуенилрибонуклеазы. Реакции с альлепшвмн анроко исгользуются для ф «с»ими однпцедочечных участков ную синовых «испат при изученим их с помошыО жыктронной микроскопии. Вз»имодейеиюе с «вот»спуд «пологой.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
