Ю.А. Овчинников - Биоорганическая химия (1128694), страница 62
Текст из файла (страница 62)
Таким образом был восстанпвлен целый ген, пригодный для пря ои экспрессии интерферонв в клетках Е.сой. О ень еа мым валяется использование сиитетическик плигонуклеотилов в качестве гибриггизациангщх проб (зонде«! для пояска нумнык рекс бинантиых колоний в генноннгкецершех экспериментах, Олнгонуьлеотиа синг«зируется в соответствии с данными, оуеии м нз й ру ур бл ил ДНК, сл введе ия ю с«вой ме.ки тр используетс» лля гмбрнлизвции ат гп яш с рексмбмнанпюи ДНК бактернальных «попов, выращенных на ннгроцеллю. озных фмльтрах и иммобилизован ых на ннх. Длн юга чтобы попс«нудно о гена был эффектна ым, олмгомуклеотнд долл ен иметь пщледовательность. комплемснтарную фрагменту искомого сна. Есъ:стеснив, чем больеге длина и!клее гида.
тем меньш вероятность встретить соотнетствуюшую ему посжлгг. эателыю -гь одно ремеино в нескольких учлет а» генома. Необхо- дима» дли»а алию ауклеотидв. в свою очередь, зависит от слоьк пасти шиомаь чзм ои ело яее, ш аиа должка быть больше дл» обеспечеиия уииквлыюго уз кваки». Рас сты показывают, чзо дл» специфичиога св»вышки» с геном в шььоме, иаир»мер дл» баитериофага 3, ластитачиа длина ! 2 иу леотидиых зееиьев, »аследаеателыюсзь (5 ьееиьев идеитифицирует уиикальиый геи а дроп «еапм геиоме. а (8--20-члеи ые олигаь уклеатиды используют дл» п иска генов в бвике геков млекапитаюш х, С се ь уклеииае ясла г ( ! 5- гс ьтс( -3' 3' — ЛОСПГ ОСт К»СО-.
ДНК ш а с-О 'л (а! 5' -ГССГ Ь'ГтСО-3* 3' — ЛОСГ !»»ОС вЂ” ДНК * 55- ГСС А С »СО СС вЂ” 3' (в! 3' КОС тост т ССОО ДНК е ь, л Оспбое есто зая мает область пр меиеии» синтетических олигаиуклеоьидов Лла вес»сияя иаир»зле иык изыске»ий в структуру ши» в 'затем ветру туру со иеетствуюшего белка, ивзььвземая белксиюй ии еиериеи. Чапье всего дли зтаи ьили гены клоиирукж в ДНК ииз итык фаге», хат» еазм жью приме!виве и других шкю ров. явор»мер пгазмид Дл» таге чтобы в»ееьи мутацию в опредеШияыи у аст шьж с изв спюй структурои. клаиироэаииага фаге (М(3 или бн.
сиитезирует я алаьо уклеот д, чистичпо «амп лемеиткриыи гьосшдовательиосги, отара» содержите» в (-, '! -цепи Д НК одиоиитевога фаш. Отступлеиия от ком племеятариасти в сиитезироеаииом олигоиуклеотиде апрсделяютг а задаваемой мутацией. Эш м т Г ьроста м иа компьим итар»ого иуклеа ида и» лругои, иекомпьимеитар ыи, жьлеци» или вс.
авка иескслькик яуклеотидац квк пакишио ва рисунке 2(б. Частичио комплемеитвриый сиигетическии олигаььук.чеотид ибридизуетса с алиои из испей геиа и одиацепачечиай фиговой ДНК (рис. 2!73, и затем с иомоеьью ДНК полимеразы (не алержапмй 5' ° 3'-э зоиуклеазвой «ктив ьюст ! присутствии четырех дезаксииукшозидтрифосфэтав сиитезируетс» егора«цепь, причем синтетический олишяуклеотид игр»ет (юль затравь и. Виовь абразашииа» двукпеп е иая ДНК кое»лепт»о шмыкается с помошью дНК-лигазы. Эта дНК представ «ет собой гетсродупшкс, в ь отаром «омплемеитвриость шрушепа в мес е введеиия мутации. Одна цепь гечеролуплекьа представлает собой дикий ьип, а (»ругая — мутантный.
Ковале«тип ззмкиутым гетеродупьекспм трвпсф рмируют я к ьспи Е. сой. В результате репли ации эзи пр екал (ькб ~кч з""' ГЕН ыьэ раз ! дни В л еЕ о! 566 Нукле новые ы клетки содержат «ак мутантные, так н днк е фа!и. Сме ъ фа!ов выделяете» н выееваетсв на чашки Петри таким образом, чтобы кажный фвг лап отдельную «олени«бли отличия дн«их колоний От мутантиых иепользукпен разнообразные методы -, биоло и асане, «ели мутации меняет биОлпгическую функцию, 1мстрнктный анализ прн нарушении участков расщепления реетриктазами нли бридизацни е панга«у«лепт«дами, исппльзоваиииммся дли ввешния мутаций. После ии' д пс ееа тпм, то не племеггарные олигенунлеотнлы образуют е ДНК значительно мемее стабильные комплексы, чем комплементарные олиюнуклеотиды н и брилизукнциее» при биле« высоких температурах.
Поэтому гибридизации е ДНК фаюд фикеирошнных на нитроцеллюлознык фильтрах, при низкнк температурах при«ндпг к образованию комплексов «ак е му!нитными, гак и с диким ДНК, в при высокнх— только е мутаитиыми, «Оюрым синтетический олнгоиуклеотид полностью комплементарен. Напрввлеинын мутагенез е нтез но еде али реальным со«адане Се«код обладакнцнх измененной биологической активгюстью. например получение ферментов с улучшешшми гаойства- Н 1 Рне т*1 Аь Ы Нть сее Су» 61у 5« Нтз сеч 5' А Т1А ТТ 5 А А Т-Т с А16 1тТ бтс ААт сА6 сАс стт таТ 66Т ТСТ сАС 3' 6ТА 6АА 6АА АСС Асб ТТС ССС АСА САС САС 6ТА и тт 66 ас аа* ааа шт 616 ат с сш С б туг Рш Рке 6!у ш ш шу суз ча1 сее ту Рте а с у ткг А«9 А 9 бть А!е 6!е Азр сеи 1и ъ«1 ату ~чб Асс сат сат адв сса 6«6 аде стс с«А ата аад лл таб аса асл стт сас сто ста с«с атт сдс ест сАА 666 с16 АА6 Аст ссс бас ссс саа асс Тсс ос н атт ССС аАС тте тад бао Саб ааа АСС Саа Ааб Сее Рте 61« сео 5е у А1а 61У Р О !у Сгу д С АТ, а 6«61у 5« сее атп суз А 9 сгу и е уа! 61« с!е Ф ле т сс с а сва Ааб сат, Атт ага ААА с«а СР ссд Ааб 6Ас бтс ттс бсд ссб тАА сбс ст1 атс Ат 6Ат сАА сат сАт сАА 6А6 атс ААс сАт с1с сст сбт «1 е !д т*г 1ег А«и суь туг Аш 61« с*ц 6!к 1у с* 5«г суе СТ6 твт се ло е 6 А Ие 6 С«6 ьн' атс Ате сеэ С1п САА т«1 СТТ Е С а ш.
С 6 АСС в Таа сее 61у суз Тб Суз АС6 ое Рт А 6 С тЬг „6 С а« бс 11. СТА 1! е урэ акти»ного центре фермент» и его омплекс» с субстратом, то с помощ ю направленного мутегенезз н геинаииженьрных приемо можно заменить определенные аминокислоты активного центра на другие, изчеии» тем сэмым к»пиитические сербств» бчрменга. Тек, Д. Фершт, Г. Винтер и сотр. (Великобритания) путем зэмеиы треаиии» не еленин а активном центре тирозил-тРНК-синтетазы улучшили константу смшыв»ния фермента с ЛТР в 100 рэз.
Тэкие щти улучшения стерн» и создания новых белков открыв»юг большие эозмалсиости для мсщцнны и биотехнологии. В последние инне в связи с интер»явным рвзмпием фмзико«нмн всход биологи», генном инженерии и биотехюнюгни все зозр»стзющее врвктическое значение приобретает химико-фермент»тивныи синтез фрагменте нуклеином«х «нсют, в том числе им усстееннмх генов биологи эски активных бептндоз и репко В ч»отнести, в СССР получены б»ктериельные штхммы, способные нролтшгров»т нроннсулин человека — биосиитсги ескнд предшественник инсулине. Проиисулни состоит из одной щчштнмтиднод цепи длииое Во »ми нокнслотимх остзтков и может быть превращен э ч н я н э — т ь е пг Ы "' " .-1--; э г е ж»Б ег е рнЕн г Т днн Ар' н «е хр* н тн р г гжэ » м мт е э е ' э х е э р ы 3 э.
3 гз м э е г т рг тэ 1 зднн гг р~юр РРЖ»' Ве ТРТзч'ТР зе юч "В 1 ! тдмн гг ь ряр Нукле овыв слог ге гр ) к и м н (юю в мм.ш Ошюз) ~с в пп :пон ) 0 Э И чт . эиюантазю 'э ч в инсудин путем направленного оротео»мзэ. В основу бактериальшт ов —. прод)центов цроинсулннэ гелозена па о коны рекамбинаитные олазмиды, несушке с нтетическни ген проинсулина.
Эю последаватсл несть фрэгмеюа ДНК. ллииой о огю 300 нуклсотнднык пар, долу еиа химико-ферментатмвным синтезом (рис. 217, 2)В). С использованием синтети еского гена были получены бактериал ныс шгвммы — продуцеиты проинсулнна человека в составе мерны» белком в частности гибрида с р-галактозидазой Е.соЬ (рис. 2)9) и ибридэ с н-амилазон В 'юоб)и. Во «сек с у юлх достигнут высохни уровень экспрессии проннсулнна, кетормй преврашалск инсулин путем ферментатнвиого гидролиза. В (902 г.
сруппами М. Н. Колосова и Л. С Саидкхюгею был завершен палныи химико.фермеитатинный гниют структурного лейкоцитарного юиерферона еловекэ ат. Иснусстееннын юи интерферона (рис. 220) кодиуует цолипсптид длиной )бу аминокислотных остатков. В процессе синтеза «одируюши триплеты были ФР 1 м -су! А:р-с, Р -61 ть -н 5 -с. -с11-5« -Аа Аа 11 1 му ( 'а ' -"у а!асс а а!53 ' '.
а!Сада! 656. АТО* Таам Ф ' 'у Т. ' "': '=~:уаа3а!Тааас!Тааа3атф' АМ '„ Фр * Н 31м дсс"адд Тета дта''Аса атс,.ттт сда! ',Ттаанада:,Ааааадт ам..дсааада. дауа,"!166' ссрсадаусдбссас Саа..ДАД ааст' 3'-,. '3',;:" ас! Тта "тст:.Стд".т ФтаФУ ~~ Р1С!У-РЬ вЂ” А Р-Н вЂ” А63АР !у — С „-Су — 5 — РЬ -С 5 а Ад О3 м, О1"О\ — РЬ -С1у-А — О' -Р1 -О1 -.1у .-А1 -.С1 -ТЬ 6*-Р— у !.-1.
— н с"т 'стс дд63сск тта..атс' дда атс.'тттс! ...ь . Й ° ", 'Ф,:.', . Фр* 111 ОТ : Т1 б1 д р Т,р — М вЂ” А1*--5,.-5 ..А р -' у ! — 5 РЬ вЂ” 1 А . 1' - 11 — О1 Ар — Су РЬ -Ту -11 - О1 1 -11 — О!А.О! -ЬР -А — А р — С вЂ” Са — А! С д ттс тдс дст адд ста тд сда сда ста дс сдс стс ада сст '"', "у тт дда дта тад сут адс дтс стс атт сма пт сда сдс с!с сад „ 61 А -Тс Ф е* аа Фр 1Р 51' сда адт аст дтс с с утт сдт сда сса да! ттс аст дяс Асс Адс асс 65, А 6А ТА6 ЬА6 ААА 616 6ТС с" Т'3, ААС ссд Тус 166 Т'а саа , А331 а -5 ° А р-61 1у — м 1-1 р -1' — 1! ° О1 -ТЬ 3 м 1-О3у- У 1 — С13 А«З ., 3- У 31 Рь с1 .А6.11 ть сд ту — 1 -ЬУ вЂ” О! 11 — су* ту -5 -Р Фра Р \ ,Ь 6 Саа',атс" Аау.'ааа" Саа ааа, 6ДД' раса, Дай: аАТ .;";,аж*ад 'Д м536%ус! 6661::,5 ..! !- ' "".:.':: т '.
'т'. ттн",-"т' ., сд ФТ" С1. - ДТ -и 5 — 1 .5 РЛ вЂ” 5«.-д.а-М 1-3! - О1„-ау -А.а 41 Уа '61 Уас а."сас. ТСТТ 66656636'Стад. с 35'* выбраны в гпспветстаии с частотой астречаемостн в Есой дчя достимення высокого урзпн» экспрессии гена.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
