Ю.А. Овчинников - Биоорганическая химия (1128694), страница 61
Текст из файла (страница 61)
60- и лагке (СО-эзеииые ели г амеры. С о)еюй стороны, зто привело к ) прон!синю описанной методелогнн (за счет сущестеен ною сог ращения числя лигазнмх реакций при сборк~ гена), а с лругой . создало осноеу дла разработки принципиально иною подкопа к получению синтетических дуплексов Такой подход„п)идложениый К. Итаиуря и согр., заключаетсн в )мпаратнпной достройке с помощью ДНК-поляьге- г а х «юхеро «дю с оп т ж (ч! е„„„„„„ч,э е„„„п -,э он пт (е) Ну ле новые с о Клонирование синтетических полидезоксирибонуклеотидов мир эр ) * Одним нз этапов синтеза искусственных двухцепо ечных фрагменте» ДНК нвэястся их «лонированне в составе многокопийного вектора с тем. чтобы сннтезированнан ооследонательнссть со«ран».
лась н цри неабходнмосп могла быть наработана в достаточньпг количествах. С этой целью синтез двухцепочечнык фрагментоз осущестелнюг таки образом, пабы они садергкапн иа «онцвх участки. илеитичные получающимся при расщеплении ДНК опрелеленнои рестри цноннон зндоиуклеазой. В качестве примерз на рисунке 209 приведена последовательность фрагмента ДНК, «оди. ргющего короткий нейропвптнд — лейцин-энкефалнн. Нарнлэ с собственно «адирующей последоввгельност ю фрагмент содержит нниггиир)юший АТО (врнсоединенный к ней длн обеспечения инициации траислации! и терминнрующни ТАА колоны, в также выступаюп(ие одиоцепочечные последоиательности, соответствую. шие тсм, когорте образунпся на концах ДНК «ри деиствни энцоиукле рестрикции Есой( и ВашН(.
Таким образом. этот фрагмент может быть вставлен в векторную плаэмиду рВВ322, расщепленную и)клева»ми Есой! и ВапгН!. н «лонирован а Е. сей. -э«э Мю гг 0)г С~г 5,'ААТТС) ЛТС тд! ОСТ ССС О~ ТАС лтх Ссд Гт(* йс «1 (еч 5г р С ТС Тлд САС ЛТТ, сгл(.;. в,.„г, разы Е.
са1г частичного дуплекса. образованною 3'-концевммм послепоиательностими двух ляминых плнгонуклеотидов, в полностью цв)хцецоымный фрапчент ДНК. Носледний после ебрвзованин на одном из его концов липкою свйтв (денствием сОстветствукь щеи (мстриктазы) соедин«стен э составе векторной малек)лы с друпгм. аналогично симтезнрованным дуплексом (рис 208, 6). Одним из примеров призм»сия» зина способ» «»ища синтез фрамеит» гена человеческого лейкоцит»рното интер4мрона а длиной 132 п. о, Хотя аераый и оп с ных ы ад д ретичес пригоден для построения генов любой длины, на практике гю мере )велнчения числа по л до»этап ных лнгвэных чсшивок становится асе труднее очищать прод)«ты рва«пни н получать нх а даст»точном лла датьнейшеи работы «олмчестве. Кроме того, Тзеличивается расход исходных синтетических алигонуклеотидоа В то же время второй полход пригоден только Лл» получении фрапгеитов длиной ие более 320 250 и.
о. В сазан с этим лля облегчени» сборки гена (очистки фрагментов и зкономии нуклеотидного материала) более целесообразно саста мпь его из отдельнмх модулей, предварительно очищенных промегкуточным «пои»роза«нем. При необходимости рекомбинантиую олазмилу выделяют иэ клетки, а требуемый фрагмент вырезают из нее де»станем двух ргстриктез, «ак показано иа рисунке 2!В. Если синтезируется очень длинная последовательность, то снншз нзвнируют таким образом, чтобы можно била «лавировать составные части последовательности (модули! Оо отдельности.
С ез иу« е ио ых « с от Е сй! Ессй! Есод1 М!+ В Н( ш( ь-миомг рн! « Оэыаыз. Как но«азана выше, лл» успешного «лонированн» мояулен снн тетичсского гена на определенных у асткак еш ооследовательиости должны содержатьси поцходнщне скйты (мествН узнаваемые эндонуклекзами рестрикции. Эти сайты лолжны быть уникальны как для са Ого гена, так и дл» вектора, е котором Он кшннрустс».
Рестрнктные санты необходимы для введения «агкдоиэ модуля в олазмиду илн фаижую ДНК, его регенерации нэ векторной молекулы после «лонировани» н соединении с друпгм» частями целевого гена. ОбычнО для атого используются свбты, имеющиеся е пОсле. довэтельности сннтеэнруемого гена. Тэк, последовательность, которую планируется синтезировать (рис. 211), ссщержит участок расщеоленин ВкгоН! во внутренней области и участки расщепления рестрнктазами Есод! и БаВ на кондак. Чксш ) н Н этой оослеаавательности синтезируютса отдельно н «лонируются в нлезмиде РВК322.
После размшикеннн» клон»рова»им« фрагментов в соста. ве рекомбииантных олаэмнд онн могут быть выделены н соединены по липким концам с Образованием ну»гной носледоввтелыюсти. Однако чаще «сего несбкодимых в»утренник сватов е гене либо н» имеется, либо нх мило (не более ! -2 на несколько сотен ивр Оснований (и а. ! ). Это сильно огрвничиэшт возможности химию фсрментатнвного синтеза лаухцено ечиых ДНК и создаст необходимость в раэрабои ° н нсиользовании лля пелучеиия оахниуклеотиДоа СОЕЦИВЛЬНЫХ НРНЕМОВ.
Было предложено несколько таких подходов С. Нарангом (Канада), Р. Ву (США) и В А. Ефимовым (СССР). В а естес иримср» рассмотрим одни иэ них. В его осноиу были положены медульный принцип «о струироианн» ДНК и использо ванне «ременных сайго уникалышх энлонуклсвз рестрнкнии для последовательного «лавирования етдсльных фрагментов и сборки целевого нолинуклеотида. Дополнительные рестрихтные скаты вис дхтся в воследовктельность гена в ироиэволыю выбранные мест», с Ну е новые н слог Посл ас м вин ч с що щ П с ед е с г асара еи ~ айза Н 1П1 Е«й1 Для улвленн» созланного дополнитеньнопг рестриктного санта синтезироиаинан ДНК расщспляетс» сгютветстеующей рестриктаюи, образующиеся выступающие оююцспочечны» последоаатслыю сти Улалвютсн действием УщнУкчеазы АьР о У*ас и «тУпьм коиЦы молекулы ссединяипси с помощью Тд ДНК-гщгвзы.
Разбивка послелоаательщнти ДНК на ьюдулн проводится про звольио. СААСОС Т.ТООТ, От ТОООААссд е н1- а г т«к1 ..., с....САЛСОС Т ОКОТ кС........ ...От тйсобдссй. 'йут с-- т г . „„.....сй Асос т нгОт туй 'ОАТ ...,... ....,От ТОСО ААС Сто ф1А ... та днн— -...-..с дасб1 т тООт тНВАт ..: .. ц ...... дОТ тОООААссйлООтд......:. " г а и содергкащие «акой-либо самокомпщменгарный динукгеотид АТ. ТА, СО или ОС. Дла этого песледовательнпсть гена «ак бы рвз- даигаетси и между ними вводится тетри- илн веитанунщотид, рбра- зуя соотщтстаующне рестрнктные скйты. К о ролан ее рВРППП рао ю е «ю Есор! и Вап«Н! ! Влг«Н! П г! Реномбинанп аи неманы Реиомбннангнан плаэлнда сфрвъюнгом1 с фрагмм юм б Трансформация е Е сс1г.
амп иф напил ныде;,еы е реномбиненлгы« ппаамнди рассюслеи е Есор!н ВагпН1л я ! Ваюй!ийнлл!1лляП 1 П ддттс ...;с САТСС С О "м ' ССТАС ДНКли ала 1 П ДАТТС САССТ ! Ваю Н! б ДДТТС„:;,,л - б..., ° Есор ! 1 5 фра менгы С~~"-"': ССТАС 5 Есой ! Ва Н! П :"!':!"*; 1-'-'":","!'. -'",. " сд с с т б' За11 П СПТССТ!«Т,.::„...",7,:,;; С с '~- ''""-"*-":*"гг! сдаст б' ВаюН! Ва! ! ! Плон« роеаиие а рВйллг расоюгюмгн«ю ВагаН! и Ь«11 П В Н! Ыу ле . ге нс оты г ..с гт л днк.
Отдельные модуличрра менты целсво» ННК могут бить пслу. чеиы мсбым э обсуллавшиксн метогюв лигированием синтеэнровинны» югмически олигодеэокснрибонуклсотндоц регыративнон достройкой Зцконцов дуплекса. образованного двуми частично «омпмменгврными слигомерами, или «омбинацией этик методов. Перед соединением в одной плаэмиде индивидуальные дуалексымолули предварительно очищают клонированием.
Сыма сйорки синтетического гена иэ готовьсс субфраментов с исцспьэоеаннем временных рестриктиыл сайгон нрнведена на рисунке ЫК Использование синтетических олиго- и полинуклеотидов в биоорганической химии и биотехнологии диапазон применеНия синтетических слито- и полииуклеотидав необычайно широ . Прегкдс маго при иэуюнни бслкои нередко ссущсствляетси синтез соответствующих гсгюи и нх фрагментов !соли число амииокислотных остатков не преемшает 200--250!.
Путем экспрессии генов с помощью тени»ни впервые приамов получают значительмме количеспю труднолоступнык белков и пептндо», а така» нх впало ов. Олнако на»белее широкое прнмененн» находит сравнит»льно короткие олн«онуклеотидм. Дли того чтобм придать фрагменту ну клен покой югслотм необходимые длн встраивания в опредежннмй участок еевтор ои молекулы липкие концы, синтсзируютсн так назмааемые лннкерм, т. е. даукцеоочечиые алигануилеотидм, садерпс е гюсл д е елмюс М р и у ой ген игюй ре р цнонной анлонуклеазой.
Обычно и качестве линкеров прим»ищется самоиомплементзриыс олигонуклеотиды длигюй 8 — 20 нуклеотидных завив«в На рисунке 2!3 демонстрнруюгс» некотормс типы лиикеро». Р «ю эс и! гв йро-.о .л л. !..г с-сх -. ргх-о.. л а г. г=с, с у у!! х..г, г,г с гт-,с-с-... о! у' г;,: г !о ел-о-с- г.гс -с. г.. х-оо! з, е к! в.щ! чехол — и -г-г — с -с -с о — о о> ! л !о -О с -с-.
г .-сод»э Прн работ» с рскомбинамтимми молекугпмн ДНК воэиикжт и:обход»ность замены одною типа лицкнх «аицов иа другой. Для этой цели попользуются алапторнне ли»исрп — частично дзухцепочечные нуклеотндьц соасрмащие липкие «гко, соответствующие двум разным рестрихтазам. третий тип линкерои позволяет перейти от тупого конца дНК к липкому, н их можно назвать допелинющими. Ыу е ноаье ело ы д((г.н(а ее(~тат! О с ° ° х — (.е О(г — с(О ООс Су А р (е— (О( ОАт с гс— Асл стл с)дс— — САС ССО (ЫГ Сгг А р(л щ - г.г Одгстс аг днн Щ АСГ С!А ОАС— О Г'.* С помощ ю синтетических фрагментов ДНК мо «г о молифнц».
ро и риродные гены, ввода в их опрелелемиые изменении. Так, синтетические олигонуклеотиды были нсполщоианм дли превращения гена имтерферона чело «ка в форму, пригодную для прямпй экспрессии н клетхак Е. сой (рнс 214!. Иитерй:врон синтез«русте« в мще предшественника. и сга превращение а истинный белок происходи в результате отщеплении сигналыюгп пепзида. Клетки р.соп н» могут осуществлять данный яроцесс, н поатому от ге а ннтерферона ело«с«а была (и ю(го с помощью рестрнкцнои юй эндоиуклеазы ЯанЗА! отщеплена есть, кодирующая сигнальиын пептнд.
Однако фермент вместе с частью, «одируюгпен сигнальный пед ид, оггцеплнет н «одоп первой аммиокислоты зрелого бел л Для осстанодтення полного гена к его сстатку присоеяинилн синге. ги вские фрагмент, содергквший «одоп первой аминокислоты, нннциируннцнй «одоп. а такие липкий конец Есой! для ваеденнк промогора.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
