Ю.А. Овчинников - Биоорганическая химия (1128694), страница 60
Текст из файла (страница 60)
0«гсфотржьфириым способам уааетс» стабильно яолучать 15 . 20-эвсниьм олигоиуклеотиды. а така е баме длинные пол ну«ле типы, вплоть ж 50 — 60-звс ых. В качестве коидсисирующик рса сигов в фосфотризфириом метопе рв се чаше всего применяли ь арилсульфеазолидм: 4-«итро.
имидаювьаы. 1.2,4-три«хоп«вы, 3-«итрп-).24-три«)олиды и тегрвэолидм (рис. 202). В то же время корпию щрекомеидоиившие себя в диэфириом методе сиитсза ар лсульфоклориды оюшались иеэффектив ыми из-эв ислле неге пр тека«их реакции изкого выхода целевого падук ц Однако в хода иегааник исследований (В. А. Ефимов, О. Г Ч«кмакчевз) по сиитсзу олиго и поливу«мотивов было обнаруи еио.
что в орисугстани и вторых иукщоф ных «атавизвтпров адил«ульф~«лериды «азыааются зяачительио более аффективными коидсясируюшими рсагеищми лли создания ф сфотрвзфмрной си«за, чем самы» активиые из армлсульфоазо. лидок Одним из таких иуклеофитьных катализаторов является Н-мстилимидаэол (Ме!ш). в п)мсутсгаии которого реакция межиуклсотидной но«де«сеции протекает з» несколько минут.
Использование М«)гп «ало возможность проведения реакций е пшь о в пирилиие. ио и в других арщиичсских растворителях <иио«саи, аг о и р, к. ори ть" проформ, юпроматаи). Даль«евшее усо сршеистховв ие фссфатриэфирного метода, позвогимпее проводить межнуклсотид ~ую компегмвцию эа 1 . 2 мин, основ«по ии испольчощнии в «ащстве коилеисирующи« р агентов зрилсулы)юиюрило» в присутствии 4-эамещсинык про эволиы» Н оки ей пирилина и «игюлина Нуове оаме е слеты носн, в !м о!тоос о 1 С вЂ” СН вЂ” Снт-С вЂ” НН Р > 11 о о о 1 с-стф-снт — с — нн- 4 $ о ~м оьт 1 о !меот т сн, о о ооь в" 1 1 о о — — С̈́— С вЂ” НН Р П !! а о в*-т, ьел, ес ьо =т-з тф ф е р ).
тМЕОт т.асме О ВЕ фо тМЕОЬт,ОСН, о ВЕ НО с — снт-снт с о !! т) осе 'О О ттт,е,— теле галатеи, гетраэал нл» вторичный амин (в последнем случае меюд называют фосфвмнднтным). В р зулмате «он»с»сеции образуется лннуклеотид метокснфосфин (ЛЦ, который может быть далее окнслен в мягки» условнвх с образованием фосфотризфире ((р). На»бог»с верфе«тизен фосфнтный метод в тюрдойцзн м синтезе олнгонуклеотидов (рис. 29$).
Снится на полимерэигк нгмитсляк. Так же нвк н в случае пол»- лепт»дои, синтез олигоиуклеотицов молгет быть осуществлен ступенчатым удлигмиием цепи, оазлентио привезенной одним нз «оиц в (5" нлн 3') к полимерному носителю. Синтез олигоиуклеотидоа нв полимере начал развиваться в 60-«годак усилмнми рава групп: Ф. Кремера (ФРГ) и Г. Кораны с сотр. (США), 3. А. Шабаровой, М.
Л. Прокофьещ с сотр. (СССР). Такой подход принци пиально более эффективен, чем синтез в растворе, так евк существенно обжпчаетсн отделение продукта от ис«одимк веществ, что приводит к сокращению времени синтеза. Кроме тщп, аса операции легко могут быть ввтоматиэнрованы (первые ввтоматнческне системы бып» предложены М. Гангом и М. Каруыдсом). ()Рнии»- о»ельне» слепа си тета на полимерном носите е вьвляпит следующим обраюмг С' щз Г ю»оы» со я ( о«ее Длэ осуществле ия таким се юобом синтеза достаточно длинны« полимеров необходимы высокие выкоцы на «ажлой стадии «онденсэпии.
Существенным фактором успека при твердофазном синтезе «власте» также еачест а полимерного носителя, который доллген быть инертным, с держать стер»чески доступ ые функциональные рупии ЛЛ» присоединения первого звена, имщь достаточныи размер пор. чтобы обесеечить са бодную диффузию реагентов, н, наконец, иеспег( фичес н не свезыщть рсагенты н продукты. Нук е новые «нс огы |м,ог.т снг- щ гм.ойт,ос» и и' к „ О ро, си Огог — он о — Р н Найден целыи рнд полимарое уяовлепюряюшнх эт треб ваннам. К х зис.ту отищятся полна рнламнд, полна рил орфалнл.
потнднметига рнламнд. пол стирал, сил . атель, пористое стек. о, бумага и т. д. Снн езыолиго уклеотндовс спользоввннем фосфатного н фофитгюю фосфотрнафнрных методов приведе ы на ргюунюзх 203 н 304. На нер й стадии нуклеоэнд нригоеднниюг с п мощью якормгй группы к полимер ому носителю. Зеты его 5'-гндрокснльиую группу вебло ируют «нсл гной обработкон н нондеисируют с пук. .е гидным компонентом. У обгизующсго.:я палиос. ью защищенного дннуклеозидм офосфвтв удалнют днметокснтри. ьиую группу присоединяют следующий нуклеотид и т. л, На послелнен стадии продукт отпыщ яют от полямериого носителя. сииьгают защимгые группы и оенщают хроматографиеи ю и зле трофорезом полилкрнламидном геле. фосфотрнэфирныя н фосфитный методы дают высокие выходы на «а лых стадиях синтеза н с успехом используютс» дл» сннтею олнгонук.могил в на полимерных носи елях. В настоящее вр» ю существуют синтезаторы олнг уклеотидов, работающие по заданнон программе.
Синтез лолирибонуклеотидов Сы з иук, авык кисло Синтез сравнительно коротких олищрибонуклеотидое но ет быть осуществлен химическим и: н фермемтатнвным методом. Более длинные последа ательнос и получают Путам саванне на кароткик фрвгмен ов с помощью РНК-лизаты. Ферментазивиый синтез алисарнбонуклеотмлав. Квк правило, лчн синтез» сщюнищлыю воротник фрагментов. - дн- и тетрануклеотилов используют реакцию, «италиа (немую рибонук.теазвми О О Н ОН Н у ЛН т О О. В а О О КО 1ю но О 'О (гб) Р() е н ю б т в Эта реакцн» обрати» реакции пщролизв н заключветсн о взаимощйствин 2',3'-рнбонуклеалидциклофасфатв (2В) (иуклеатидный компонент) с 5'-Ончруппой рибону леонида (2)) (иукщозиттный В, В В; В, О 11 сн, ос-сн сн «СН, ОН (гг) (в) В, В, В, В В В, В, В О ОС вЂ” СН * — СН сн О ОН И 1 2 ОН ОН ОН Ну е оа ~ .
с ты ~-Оа (МеО) Т О Ол ОСС ОД -Ой (МеО)г),О а, ОН -ОН ' о: г НН,ОН б б, ЕО'О НО ОЯ НО К СНС О С НгС ' О компонент). В качестве нукюотндного и нуклеозидного конпонен. тов выступают как м номеры, те«и огнгонуклеотиды. При использовании неслецифическик рибонуклеаз (таких, как РНкзы из Васйюз знюй(з нви Репгс)бюгп ьгснсопграс(нпд природа оснований В~ н Вт не о кюь сущесткениа. Могут бмть применены и специфические РНазы, например гувнилрибонуклеаза (РНвза Т,). если В, предстащяет со(юй гувни, нли пан рсвтическвя РНаэа лля пиримнднн вых оснований.
При увеличении длины синтезируемого продукта вс» большую роль играет его гидролиз РНазами. В такам случае дл» наращивания цели выгодно испольэовать специфические РНаэы, неспособные расщеплвть уже имеющуюся цепь. Помно рибоиуклеаз, ллн ф:рмеитатнююго синтеза олигонуклеотндов находит применение нолэнуклеотиш)юсфорилэза (ПНФаза). Дл» того чтобы бмрмент п)юсоедимял только одно звено к Зчконоу слигоиукщотнда-затравки (22), одну иэ гидрокснльньщ груни д бюсфата (23) блокируют сбьемнстмм аципьиым звмесппел м, к юрмй после реакции удаляют мя.кой щелочной обработкой.
Синтез олигорибонуклеотилов может быть осуществлен «омби. нвциеи РНвз и ПНФазы. Хиюеческий синтез олнгорибонуююпидоа. Олнгорибонуклеош г синтез ру ф:ф цлзфиргым, ф сф призфир ым и фосфнтным метолами с нспольз ааннем э основном «налогичньщ приемов и реагентов, опн киных лля ДНК-рада. Дополнительной пр блемои является необходимость избирательной защиты 2сОНчрулпы рибозм, а та гке лабильность фосфодиэфирной связи оли о- и полирнбонуклеогилов в щелочной среде. Фосфодиэфнрный метод был использован Г.
Кораной пля сингеаз ю:ех ди- и трнрибонуклсотнлов при установлении генетического опа. Пример получения Рпболннуцюозилмонщ)осфата с применением фосфодизфириою способа дан на схеме: Рассмотрим один из прнмероа синтеза эащмщенного рнбоиуклеозидмонофосфвта (24! с пом щью фосфотрилфирного метода. В этом случае с целью защиты 5'-гндроксильной группы испольэоиана о-днбромметилйензоильщя зашита, котораа легко снимаюхя действием ионов серебра. з 2'-гидроксильная группе рнбозм !окируетсл неустой овюи в кислых условиях метоксипирзннльной группировкой Остальные эашитныс груням н «онлснсирующие агеипч ие отли юютсн о нспользуемьы в сии еэс «лищдсзоксирибону леотид в С е» нуове .оеых кнс от В Вт к' мййт бм Н4! С 'б;д' О Тд Одним иэ примеров синтещ щюродиых рлбаполннуклеотндов неляетсл полныи химико.ферментатиеныя синтез дролгмевой алаииновой тРНК (рнс.
205!, осуществлеимый большой группой С РРОССАОАб бОСОССОСТЧ'Сб АООССОСАСОСООССАССА — Р [ТС'г[ктг г!звт г! СОСООССАССА — Р САССА — Р САССА — Р Сю(уббблблббОСТКСббТЧ'СОЛО(ГССббАССКООССАССА — Р [Т чг[ктг Р' Сш[грбббйбйбб(КОССббРРСОАООССббйЮЗСФЖСйфбд,гнк г, . »ь ть» китайских химиков под рука орспюм профессора Ван Инмеап. Отличительном (мобенностью синтеза нвилось то, что синтетическая тРНК содержали минорные нуклеотиды. Для синтеза 76-нуклеотидиая последовательность трик бьща разбита на о олигоиуклеотидных сеп ентов величиной от 9 по >9 звеньев. Синтез этик сегнентов был проведен фосфогризфирным метод и, полученные олигонуклеотнлы далее соединялись друг с другам прн помощи Т4 РНК-ли(вэы, ктк показано нв рисунке 20б.
Изучение биологи и- ской активности синтетической тРИК покавхло, что она обладает полной активностью природной дрожжевой алаинновой тРНК в резаниях аминозпплнровапия и образованна пептидной связи па рибосоме. НГ е овые «полоты Химико-ферментативный синтез фрагментов ДНК К мплекс современных методов смнтезв нуклеиновых кислот позвОляет исход» из мононуклеотнд в получать гены, кодируккцие белки ллиной более ! 00 ампнокнслотиых остатков.
Первым маном работы являетсн «имическнй синтез оли одето сирибонуклеотидов, которые затем с помощью ферментов иуклеинокого обмена, тяких. «ак Т4 полинуклеотндкиизэа, Т4 ДИК-лигам и ДИК-полнмеразы, преврашаютс» в двухпепочечные фрагьннтн ДИК >>мс. 207!.
Мето- » днк ( ОН У 5' НО ' и'' >НО сей о-с-л О тб П! со л.а.„, „44В~~$$ . Ю ОН>' ™а-'Сгй(С т > О ОН»' 54> 00 (, (Ь> О! ОН 5 НО ОН>' ОН 5 5'ОН 1 ° З*ИО'*О (РЛД ' О.Г ~:с'~"~ и р ,.Ф.~ф,„. =пф 5пп (>М 5 '' 'Ийта >.о Онз Он> в Он> ~ т. 4.(- ОН5 ОН 3' рй>Рййайфйбйвувййй(зй С З-С-С-О С-О-О:а-ОМ рани(яеяввд, >и(зюянвен рюмзипмпв ОН 5' ОН 5' полотна сборки синтетических слнпзчероа в протяженные дуплексы вперяые была оредлогкена в коппс 70-х голое Г.
Кораной н сотр. и дслпю щем» остаеалась практмчески немэмеимой. Разработанный нмн подхед (рис. 208, а) состоит в многпкратном посщдоевтельном соединении при помощи Т4 ЙНК-лпгазы (Π— 20-зэенмык елнгонуклеотндов с комплементзрными, щзимио перекрывающимися последоаательнестнми оснпяаний сначала з небольшие дуплексы с еыступающими одиоцеоачечными последовательностями на концах, э затем . э целыи ген, который клоиируют в «екторной молекуле (см. с. 43!). Этим способом бью получен цптый ряд полинуклеатндеа. п том числе гены некотарык интерферонов человека, «длинен более 300 п. о. ~мднк * ~ мдн - ~аик»п 1"'"- * 1 гг лнк— 3 Р е мдю:- С«»е йду С " "" ау"" д г и)юю и л) г иж а С развитием методов синтеза олигонуклжгтидое стало возможным пщгучать чисто «имическнми способами 30 .
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
