Ю.А. Овчинников - Биоорганическая химия (1128694), страница 58
Текст из файла (страница 58)
По следннй фрагмент осит незнание болынопг фраг енте ДНК поли сразы ! или фраг с тд Кленоез. ДНК- р у(и РР,,К о р щ,у ° в ге он иныенерин и при анализе структур г ДНК дла юпол ниа 5'- сгупвюгци» одмоцепоееаных конно или цля удалени» 3'-выступ ющих концов. В пертом случае этн ферменты проявлюог ДНК-оолимеразную актив ость, в ео его(юм 3' 5'-зкэонуклеазную Прн заполн нни выступающих концов со!юр кащими реп эк у у 3 с ндр4 ф* ДНК з меченной по «онцев м зшньям: По мере си тета удлинив ся 5'-конг(ем» фрагмент и у орачмеаетса 3'.концевой фрагмеи В рсзуль те 3'-ко це ои фрщ.мент момстбы ъпелгюстью экмещ и внг ь гни езироващюй ДНК Если Лдл ник.трансляции пел»львов.ть меченые трифосфаты„то сиитечирова на ДНК получас ся меченой.
ДНК-по»им»раза баитермофага Т4 ~юлуч ется иэ клеток Е со1. иифицироеа иых б к сриофыом Т4. Фермшп обделает дНК-полимеразиой и мечи ель о более мчсокой по срзвщ:мию с ДНК-по сраэой 1 3' 5" экзояукщаэ юи актимюстью, ио, в отличие от посщдней, не проявляет 5' Здэкзоиуклеаэную активное ь.
ДНК-тюли ераэа Т4 мол ет быть использована в оса» ном 1а мс, как ДНК-поли еразв 1. Сильная 3' 5'-экзонуклеаэнв» .к им ость позе мыс при енщь )мрмент для вас»сии» е и а ДНК без выступающих концов и с 3'-выступающими ковцамн К даухцепочечюму полинуклеотилу добавляю ДНК-полимераэу н один меченый »НТР. Фермент з счет 3' 5'-авзоиуклеаэной актиеиг н удаляет укяеотнды с 3'-конца ка дой иэ цепей вп оть до нуклеотид, ю тарый содср кнт то х'е ге ероци«лическое а но за ие, что и добавлен а смесь »НТР.
За удалением этого таси» следует его восстановление за счет полимсраз>ои ак и ости фер. ,ен-а. Текин обраэон, усгщгавлиаается псевдоравноеесие проис д г в ю Зч«ггц г з д При »»»до акте включения используется олекула »НТР, ори отщеплснни удаляв ся 5'-иу еотидмоиофо фа . Резуль а ом рс цни являет'.» «Реэраще ме рифосфата а моиофосфв . Реа ция идет цо тех оор, гюьа не израсходуе сз весь иуклеоэидтрифосфат.
После ато о на»ивашев а юнуклеаз ое расщепление, которое м е привес и к полному млр лизу ДНК. Особое зн ченис имеет бермеит РНК-эванснмва ДНК-полимераза (обрати»и транскриптвза) (открыта ! . Темины и независимо Д. Ввлтимором>„источнико г кшорой обычно слувгит вир>е миелг бла оза пт ц Фср ещ, подобгю ДНК-э»виси ым ДНК-полимеразам, осущеспшя.т щ си ую от за р» ки и матрицм по ~имеризацмюдсзоксинуклеоэндтрифосфатод синтезируя ДНК, о п ементврную матрице. Затравкой слух *т дезоксирибо или рибонуклеотнды, одна о в «ачес ве м» рицы, наряду с одгюцепо ~сеной ДНК, )ирме мопсе испольэова ь н одиоцспочечную РНК Ферм 'нт бл д ст щкде активное ью рибонуклеазы и способен дегра.
дироаать РНК в гибридном ко плексс ДНК.РНК. Деградаци происхоггнт по вазону цюму типу ак с 3', так н с 5'- онцов РНК. Образе~ма транскрнптазм ианбо ме широко исп льзуются в генов инде ерин для полу ее~на дНК, ко племситариык ма ричнь м РНК. Ва кнеишим каассом явлию я щ лч: ДНК-зависимые РНК-полммераэы. Зги фер енсы квтвлизируют сигпез РНК, «омплементарных ДНК- атрнцам (транскрипгшю), используя в качестве субстратоа рибоиуклеози)прифосфа ы. Об цая схема синтеза такая мс.
к к и > ДНК-полимер з, однако РНК-полимеразы сгюсоб ы н и пть синтез без загранки, т. е. инициировать синтез РНК. Си нал инициации синтеза заключе в специа»ьных регулягориых последователь юст х ДНК, гмзыеаемых промоторами. !Вплее подробно о транскрипции см с.
4111 Сущестиуе такие большое число ферментов, аналогичных пглимер т, но способных к бе»матричному интезу полинукщо~идоа нз них наибольшее применение нашла концевая лсзоксннуклеотмдилтрансфераза (терммиальная трансфераза). Ко це ая нуклеотидилтрвнсфераза (нз тимуса теленка) осущес еляет по 'левов»тельное рисоедиисиие нуклео ид»ы твеиье к 3'-ОН-концевым руппам ДНК.
Субстратвм» слу кат леэокси>ибонуклео- С гвз нуюин новы кнс ог З в(а1» гй д(г тю), зндтрифосф ты. В присутствии ионов Мй' ' ферме«и пренмущестгеиио использует н качестве зат(жаки одноцепо ечные или лву цепочечны» ДНК с 3'-выступающими овца и (послед ие огут быть по «мены нз полное ью двухнеппчечнык ДНК с помощью зкзоиухлевзм ф га г.). Од зко в присугювии ионов Со' орисоединение нлет по любим 3*.ОН-конце мм группам дНК: ьгу пе ' оа мч и» к 5' )( 3 В результате к 3"-ОН-групгжм ДНК присоединяется полидеэоксирнбонуклеозиднвя ощюцепочечиая последо ательность, сосгаи отарой зависит от состою смеси дезоксирнбонуклеозигг рифосфатоа, использоаанимх в реаиции.
Если имеется адин единстщг ный рибюсфат, то синтезируется гомополимер — поли (йд). поли (дТ), полн (дб) или поли (дб). Фермент используется в генной инженерии при клониро анни фр пчеитов дНК <см. с. 433) и в аиаггизе поспею«вательности ДНК для нвсдени метки по 3'-концевым звеньям. ДНК- н РНК лигазм. Существуют ферменты, сппсобные соелиннть мегкду собой фосфодиэфириой связью целые г)грагменты ДН К нли РНК.
Такие ферменты гмзыюющн лигазаии. Из поточи л ного семейства лигаз наибольшее применение получили ДНК- и РНК.ли взы, сигпезируюгчиесн в «. еткак, и~фицнроввнпык багтсрнофагом Т4. Так, Уг ДИЛ'-лнеаэа катвлизирует обраэонанме фосфодиэфирной связи мегкду 3'-ОН- и 5'.РО,-группами а оююцеппчечнмх разрмвах двукцепочечных дНК (схема н! или между такими же еруппами лвухцепочечггых могмкул ДНК, содер:кащих нв концах комплеменгариые олноцепочечные послеловазелвности (схема б).
Такими камплемемтарпымн последоютельност»нн могут бым в частности, адноцепочечные участки, обрвэуюшисс» при ресшеплеиин ДНК какой-либо рестриктазои На схеме 6 предо вален прммер образования липких» концов при рве»кеппен«и ДНК рестриктазой Всей). Со значительно меньшей скоростью, по асс ме достаточно эффективно фермен саед«ивет ме»кду собой пол. »остью двуспмральные фрвпеенты дНК с 3'-ОН. и 5'-РО,-группами (схема е). Фермент использует а ка»естес коф «юра АТР и требует для рабаты присутст»ин в среде нанон Мэ' '. ДНК-лигаза широко испальзуетс» в генной июкенермн для соединения фрагмента» ДНК и прн к«мико-ферме»тат«виан си» теэс ДНК. РНК-»игала катализирует канале«тиас связывание одиацепачечиых ДНК или РНК, прн условии, что они содсркат кан.
цевые 3'-ОН- и 5'-РО,-тру»юы. Молекулы, юдердашие 3'-ОН- грунин, примято называть а»инпар»»ым», а 5СРО» — доюрными. В роли до оров «ыступакп олнгоиуклеатидм и даухцепочачныс ДНК. Минималь ымн донорами могут быть нуклеозид 3'дчдифюсфаты РНР и рдмр. Налирибаиуклеотмды бошс эффективны в качестве а»цен»про», чем полндезоксирибануклеотидге. Трииуклеаэид. дифасфаты НРНРН вЂ” ОН являются минимальнымп акцептарвми Эта реакция ян»нрава н» нллюстрируе ся схсмои. 5' .,РАРТРС 5' 5(,СРТРА 3 »НН ы* Ыэ»' АТН РНК-лигазу широко используют для а»еде»ил метки а 3' концеаые звенья РНК. В «а естес донора» слу»кат 5чпр-меченые 3',5'- уклсазмлдифосфаты.
Фсрмснт находит применение в химикофермснтатнвиом синтезе полирибаиуклеотидов Добавление его а ДНК-лигазе эючнтельна )скарает реакцию «сшив»ни» юукцепачсчнык молекул ДНК. 5' -р»рурбрСРТРА 3', .РДРСРСО ° + ирыр Лтр Мэн»*НН- еы —.РА»ОРО"рмр 5'НООРСРТ В резувь ате реакции АТР нрс ра (ае ся а АОР. ((«юза осушестюяет твк»кс пбиен 5'-концсаы» фосфатных групп олнго- или по ииу тео идо» с Т-фасфатной группо» АТР в прнсутст нн из.
бмтка АОР. Фермент используют для юеления мечевых фасфвтных групп 5'-концевые э»си я ДНК. Пл» это о применяап АТР, содсрмаший радиоактиыа»и а ом фосфора ( ' Р) е т-пало»кении: ирррА. Т4-полииукяеотидки аза ш рока используется дл» фосфори лнрования олиго- и палнвуклео идол прн работе с рскомби»ынт. вымн дНК, при «пинка-ферменгативаон смнтеэе иуклеиио ых кислот и о»ревеле»и« их последоыпельности.
РРА " 5'»ОРСРТ Следует упомянуть так»;е ферменты. которые прнсаединяюг фасфатные группы к ДНК н РНК, — та» называемые лалинуклсогидкииив». Для еключенм» метки а 5'-концм ДНК (или в синтеи ее«не оли'онуклсотиды) ширака при сняв ся полинуклеотидкииаза бзктериофагв Т4. Оспа»на» реакция, кателиэнруемая ферсн пм, заклаюэе с в переносе )-фпсфат»к»й группы АТР «а 5'-ОН-группу ояиго- и воли уклеотидое. Фасдюрилируюыя как рибо., так и дезокснрибопраиз одные. Скорость фасфорилирования двукцепачечиых олекул несколькп ни»ке, чем одноцегочечиых. Химический синтез олигонуклеотидое Ну навив кислоты Фг Фол'Е ж я а д О О !), 1 ИΠ— Р— ОР. — ИО-.Р— Ои О ИОН О вЂ” Р".ОЯ «ОЙ К -Р— Оя' — ЕО-Р— ОИ ОЭ' Оэ МчО-Звщнтные группы.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
