Ю.А. Овчинников - Биоорганическая химия (1128694), страница 54
Текст из файла (страница 54)
При вщдеиии в реакцию любою аналога ДНК-полимер»ы с поределениои вероятное ью включав ещ в цеп »место природ що суйс рата, после чег с итет цепи обрмваетс . Вклю |сине аналога пр похолит о з «ону лу юя . юбом мест синтезируемых цепки; а ит и: полу »ются наборы олищ и полинуклео идав рвали най д ы, о с олин»ко ы н звенья на 3'-хо«1«хх, щк зто пп«аз»но на рисунке 1Вй Д я по ученик про«у~тово уникальны 5'-конце синтез дНК ц р «омпжментарного матрице на участке, расположенн м ряло с 3'-«анцевои областью ма рицы. Э»трав~ а содерлит с»обо» ую 3'-ОН-группу, необходимую ДНК пол мера е лля а ала и таза ДНК.
Гибриаизуясьс матрицей в прелеле юча о вновь синтезнруе ую ДНК в качестве ее 5'-ко»его»ого участка, щт Ну»нос«соты к т ип, мы а щ а а ам л р э э т смх т ы а* " бщ затравка пбеспечи»ает уникальипсть этого звена )щ» асех наборов специфически абараанных копи». Для тою тобы сиитеэнруемые продукты били радиоэктивнымн, в «ачестас адиаго из четирск природных дезоксирибонуклеозндтрифосфатон используется [цэтр)-мечены» продукт.
С этой целью смесь затравки и матрицы разцеляется нэ четыре части: с Одной проводится синтез «присугсмми 00ТТР с образованием фрагментоа, тер инируемых тимидином, с другой . л присутствии ОНДАТР, с третьей э присутствии ббСТР и с последней — н прмсутстанн б»СТР. Все четыре радиоактианых набора продуктоа наносятся на параллельные дорожки полнакриламилиога геля, ра д ю ся, рэлиоаятографируются и аиализируютс» так же. «ак в метоле Мьксамв — Гилберта.
Как уже уппмнна:юсь, чаще асею а качес ае матрицы для анализа испольэуютсэ фрагменты ДНК, клоиироэаииые э одноцспочечиых фатах. Для унификации «нализ» последовательности кобы« фрагмента», к»о»ирна»нных в состаю даниог э фага-вектора, можнп исцпчьзоэап одну и ту;ке аатравку. Для этого затравка должна быть хомплемеитэрнэ ие клоннроэанному фрагменту, а ! т )-цепи фага вектора э том ее месте, «оторое граничит с 3'-концом «по«мрак»иной »ставки (рис.
Р35) . В качестве эатрлаок чаще асего используются сины.тичсские слито- и дезекснрибонуклеотнлы. Вл» сключения деграцэцни затрваки с 5цконца э «эче ы дНК-по имеразы применяегса обычно фрагмент Кленова» ДНК-полимеразы В. сад. Метод Сентер» наи(юлее чассо исппльзуетс» для анализа последовательности ДН К после ее неспецифичесхого рас шелле ни» и «лонироааниз суммы получаемых фрагмента». Метод весьма эффекти. эен и экономичен, так же как меюц Максамэ — Гилберта, и щ згсь ласт анализировать последоютельность свины 200 звеньев на оаном М етодн быстрого определения последовательности РНК.
Эти методы могут быть разбиты на ляе группы — прамме, «огда аналМзу подвергается непосредс асино РНК. и кос»енине, «агда анялизируетсн, например, кДНК. получение» путем «опироюния РНК с помощью обратной тра« «риптазы и «лоннрпиаин»а «спета»» какою-лнбп вектора, и и соответствующий геи, «одирующий данную РНК после анде»ения ещ из библиатчю генов. Кос»аниме метолы, естчстеенио, «»лаются методами анализа последсимтельиостн ДНК; прямые же мееэцы анэлиа» РНК аналогичны и«пплщусмым а случае лезоксирибонуклм тмлод Так жс «ах и для ДНК, мол ет бить применен метод копнроаания с тсрмннируююимм аналогами трифосфатоа, но а сото ДНК-палнмераэы используют обратную трэнскриптазу, а э качестве затравки - смгиитическне олиго«уклеотиды или рссгриктия.
ные фрагменты, «омплеменэзрнме данной РНК. Сущее »уют хиничее«не методм частичных расщеплений 3 -мечен ни к РН К, аналогичные прнменземмм лая ДНК. Различие юклю- С рое е у л новик к слог т бляц )) янт ак внц 'ЭИ и, лт нэ ион оюрммк )нр лцм м вл в н а и т еюкнт л «клюврцк( ) с е Раде).велел )я к хлво" то лвм й» чает я в том, ч о при рвсщепленим модифицнроынной РНК по образующимся рибозильнмм звеньям или их прензаодимм нельзв мсппльзоаать щечочнме ус юаня, поскольку происходит неспецнфический гидролнз РНК. Поэтому расщепление проводя в слабо- кислой среде в прис>тотами аминов Для молификации применяют днметилсульфат (О>„гндраэмн (- НаС( (С), гмдрвзиигилрат (Н) и ллэтилпирокэрбонат, которми модифицирует А н О, ио пренмущес вению А.
Однако наибплее широко распросграненм методм неполных расщеплений РНК специфическммн рибоиуклеаэеми. Кнк и в случае метода Мвкевма — (нлберта, РНК маркируют с помощью полинуклеотидкиназм го~я учконца или РНК.лигээм для 3'-конца. Затем меченую РНК разделяют нв несколько порций и каждую порцию истерзают неполному расгцеплению однОй иэ специфических РНвз Продукт». получемиме нз каждой порции, наносят в соселннс лунки плосхопг полиакрилэмжчноуо геля, ракасляют и радиоаатографируют. Недостатком метала является маяа» специфичность РНаз к данному типу оснований, а также зввисииость скорости расщепщния ат типа пснования.
Вслелстаие этого приходится использощть набор раэднчнмх РНаз с перехрмнав«цейся специфичносп,ю. Некоторме и» примеияммк ллн частичных рвсщепленмй РНаз ри еде в твб. и >К Бмстрме метели опрецеленян последовательнестн не решают воск задач, стоящих перед исследователем пераитной структурм нуклеиновмх испит, носко 1м у они не дают инйюрмацми о Положении и природе минорнмх компонентов нуклеиновмх кислот. Такие задачи встречаются при изучении структурм тРНК. В этих слу гаях сохраняют свое э ачеиие сщрме методы определения поспело ютсльности, юключающиеся в нсчерпмыющем или чассичиом ~ндролиэе рнбонуклелэами, выделении ннднаилуальнмх олнгоиуклеотмдов, опрелелении нх нуклсотиднаго состава и ипентмфнкацни инорнмк компонентов Для иллюстрации применяемых здесь методов и приемов рас мотр ре .е е структуры олного из гексвну.лепидоа, по лученных при исчерпывающем гилрплим аьчиновой РНК Рказой Т! (А. А.
Баев и сотр.). А. Определение муклеотилипго сос ава. прпаеленнос после щелочного пгдролиэа, дало результат: Ар + 13р + Яр -. '— 2СР -(- Ор Б. Из гп саба и луч ния (гндролиз гуаннлрибону«лептой) б ло ясно, что Ор должно находитас» на ушконпе. В. Ис ерпывающий гидро»из Оюсбюдиэстеразой змеиного нца пал единственныи нуклеозид . питидин.
Отсюда следует, что о ишну леатид содержит на 5' «онце лигилии и, та ин образом еш структура С(АЯ)лБС)ОР. 1'. Полный пгдролиз пиримидил-РНазой пр вел к следующим продуктнм' (СР, Арур (- Ор ! Ор н, значит, его структура С ( А,Я, О,С ) О р. Д. При чистичном гндролизе пиримиднл-РНнзой был выделен пене»ну »сотня С(ОллА,С). Дефосф рилирование н последую ший исчерпыщнлций гидролиз последне о панкреатмческой РНазои обнарулиеают среди нук.еотилов оцин нуклеазил урнлин, кора се, „,, лш, Э ц «у ам Сшловательи, тнютс аоэмо ы л«е структуры гексаиулеаица: С -А — я ° С-.(3 -Ор ни С -С-АО Ор. Выбор м жцт ними бьш сделан на том асиощн и, что среди продуктов части шош пгдролнза гтксануг еогнла панкревтнче.ы н РНазаи был оби»ру:кен лииукл«отид СРОР, а это возможно лишь в том случае, если верна ~ерная из двух структур.
В заключен е раздела, посвящемиог на изу п леда ельносги нуклеиновык кисют, с сдует отметить что новые методы пбе лечили возможность пш~носшю расшнфронать строение ряла гроот иши г ионов, к «отормм относятся блктериофагм (Х174 (5255звеиыа),О 4 (5577 твен ев),Т7 (399)бп о ),2 (4В 592 п о ), не т рых лрупгк фатов и вирус» обезьян 59-49 (522б и. о.), боль- Ш н а бактерий, »,плотных, расшннй и т. п. Эш разул ы 3 вили по- ео у глянуть на структуру и функциЮ генома и на его эволюцию.
И тем не менее сегодня в серелине ВО.« шпон расшифрована еще то ько очень незмачительнни часть генетической информации Общая длина расшифрованных последава ельиостей составляет всего лишь неско ыю м ллионов нуклес идных звеньец а это — только О,ОО! мины генома человека.
Г М Щг Щ М ' а ХН СССР д а Р ( Р Р , Р, сссг (гтю) Пространственная структура нуклеиновых кислот Если маломерной единицей ну«лепно ык «испат считать ну«- леотидное звено, то лдя описания его «онформнцнм следует учнтмщть апзможнпсть вращений а «руг овптн с»язеп (рнс. (ВЫ. Кроме того, нала принимать о вниманн по ожение о кошин» относительно углееодной час!и, которое определяется вращением вокруг М-гликпзиднои связи, н «онфпрмацнпнные изменени» фуранозиого цикл».
Все з г лслвет камформвцианнмй анализ нукали овых кис от есьм» ело ным. Конформации компонентов нуклеиновь(8 кислот Ь о сз'- — — —, (,У Гз Мт 1 Н,,*,.„м л н» н 7 А . О Цнебй 'ф О В С Конформаци» нуклеиновых кислот и их компаиентоц твк же как и белков (см с. 87), чиста описываются с помощью твк называемых торсионных (двугра мх) углов. 1>ри определении торсиан. ною угла рассматриваются три смежные свити, напр» ср А .— В, В .С и С - О [рис.
1871. Торсноинмм углом вращения связи  — С называют уюл мезкду проекцннмн связей А В и С О нв плоскостг перпендикулярную связи В - С. Если торсионный угол равен — 180, о з соответствует гране-конформации И-конфор. манна). При значе иях тор ионных углов около -1-60 или 60 конфор инни называются юш ' и гош (8' и 8 !. На р суике 186 приведе фрагмент нуклеотийной цеяи: жирной лнииеи выделен ее остов, который вклююет в себя втамм О(5'>, С(5'), С(4*), С(3'), О(3') и Р Остальные атомы углеводиых остатков и етероцикличсские основания р ссмвтриааютс» квк боковые рупии. В основной цепи мо ио выделить повторяющуюся данвицу. Если выбрать в «ачестне начала от четв атом С(3'> основной цепи, топе та«он диницей будет послслонательиость атомов Г(3')" — О(Х)» —.Р' — О(5'!Ц-.С(5')' С(4')' С(3'), л ' шн в себя шесть различных связей и, Уь 7, 6, г. '„. Соответствующие торсиониые углы обозначают так же.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
