Ю.А. Овчинников - Биоорганическая химия (1128694), страница 53
Текст из файла (страница 53)
следовательно, если лля поликуклепгнда получить полный набор «опасных продуктоц спецнфкческн «обореаннмх у определенного тина змггыц то нз внвлнза н«длнаы легко о рсдслпть полеженне данного звеню в нсхоююм полнауклсотнце. ))роков» подобную огюрацню для каждого Нз четырех нуклеотнпных Заенье», можно эмнести полную последовательность исследуемого полимера. Однако определенна абсшпотных для» фрагментов - операпн» весьма еатрудннтельна», н ноз ому современнме методы анап»за заменяют его оравы."наем длин цролуктов, оканчнаающнхся разными нпамн звеньев. Если нуклеотнды (табл. )2) записывать в аслслователь осты увелнченмя нх данны на Одно звено начиная рот г продукта (кояонка С, зете «олонкн Т, С, снов» Т.
Акт д.), у »ется ф р у Стст*СССССЛТАСС, с еегстнгн3щан последо а елыюгти исходного о «пипи!со илв. При таком ращ отренни учить!в»юге» ие абсолютные значенн д. н олигонуклеотидож сравнение ведется по «ринципу корочедяиннее . Таки~ образом, для полного анализа пес !евон»гель«ости юбого доли уклеотида необходимо иметг но-первых, метал по учен я четырех кабард« спев«финских «оиценьщ продук о» полабных ем, «оторые привенены «табли ге 12, и, но-вторых. метах поз«оляющии проводить сравнение длин этих п1юдукгов. Различие современник метл!гав нза ючае я в п бвх олучения наборов специфичес их фра «енто . Общность -- в способе сравнеми» длин, морос но всех ю:учаях пр из од ся путе злектрофореза рвдноактивнык ко«невы« продуктов в пластинках полив«рыла«и»ного геля. По окончании злектрофореза поло кение прздуктов в геле определяют путем рвдиоввгографин.
Каждыи продукт проявляется з виде те ной по юсы н» рентгеновской пленке; сравнив«1отс» отнпситсл ные подвигкности палас в разнык порожках, гюдобно гому квк сравнивались длины продуктов в таблине 1. Кнртииа распре»ежи«я полос на рис>'нке 180 соотнетствуег гюследоевтельнос и олигоиую3«отпал« а таблисм ! 2. Это с сдует из ана иза относительных подвижностей продуктов: свмнй полвигкный и, следоеательно, юмый ро И рщгу б ру и в дгр е О, сл !ующий но поцви «нпсти и длине — в колонке Т. палее -- в хохолке С, щмлующие даа з «а Т и А соответственно и т. д.
Выписывая таки образом названия «олонок в порядке, в «спором в ник обнаруживаются иосяеловательно удтинвющиес» пролук ы. получают бюрмучу н ходил о олигоиуклеотила. М стол неполнык специфических химнческм« р*сгцепле пни (метод Макс«ма.-. Гилберта! испо ьзуется для определения поспело ательности ДНК. Меченые оицевые продукты получают путем специфического расииплеиия ногину»ептида «имическими ренте«ге и по оп«о«у нз з еи а.
Обработка пронодитс» в услпаияк непоаной с атистиче- Строе е унле он и с ог Сх 3 л 3 3»от* «о ж а 3 2 2 4 5 б 7 3 9 !О !1 32 32 34 35 5 рОТСТАССССС А Т А С С>' Т*«я«аз 12. ской модмфикаш и. В Реэу ьтате по участок бп. и нвб р ркз. ли нык продуктоц н» только «онцевые олищ- н по ну«леот ды являются мечеными обнару>к ктг-я р д паапираммак. Так, напри ер при частичном расщеп енн по ти идиновым звеньям (а по .о симах, указанных стрелками> мече ина>о по 5'-кон«у олищнукл«итиля орС Т - р — С - р Т . р А С могутобраэпватыя с едуююие плигонухлеотилы.
' РСРТ, прСРТРСРТ, РСРТРАРС, РАРС, РСРТ, из «»горь к мечеными окаэь>вак е» то ько лва концевых. Для специфических расщеплении и пользу«>тся Ре» ц и, приволкщие к ува синю ште(юц лн секо и основания нз иоанну леотиднои цепи. После это о цепь может быть расщепеиа по об>юзукнцемуся дезощирибознльному звену илн его произ»одно у путем((-элимнинроаани» деиствнем Шю;очи нли а инок.
Далк р ссматрмсаются четыре реакции, и п зуемы олн м из вариан в «тода. В «ачестве пбъеюа вьбра оли пнуюео ил. привсденньш а таб ице 12. А. Расщепление ДНК по гуаиозииовым звень«м осуществляется шпалы и мплификаоией ДНК пи етилсу фа о . Метил«рощине э«трагик«стяг м азо а вполшкении (7> в С.
а а ке Н(1> н Н(3> шннксиия к А. Прод>кт непплнпи молификации обрвба ищется пиперидином при повышен«он тем ературе. При этом Н-гликозил. Р"тр ' > дрефр мент»мин образованием продуктов, содержащих на 5'- и 3' «о цах фпсфктиые грш>пы (рис. 181>, В лнх ус. ов ях не происходит ра шепления пп»инуклептилной сипи по ме и иропанн м произволным алс з а.
Из модсл но нуклео нда в Результате реакции должны получиться слелун.щие меченые плигану леотиды, образовавшиеся при расщеплении по С Ну гг оа г . «оты * о с т С С А А С о о С А т С т о "Г Д("РО. т-.о-т-д — Ср! й(хРО т С т А С Ор> Эти фраг сити отличаются от продуктов. приведенных к колон е С табяицы 12. дншь т ы, что н» сте гуан«новых остатков с держатся олька фпсфатныс группы, Г.
Ввиду пт утствии с ецифичсс ого метоц» ра шелл иия ДНК по пот«тквм «данина при сияет я испо. нпе расщепление >»пи пп пуриновм звенья . Сравните ьныи «на из реву ьтатпв цвух типа« расще мни« (суммарно по пурино ым о таткам и тпль о по гуано зинам! дает впзмшкиость дифференцнрощть о игоиук>ио иды, являющиеся процуктами расщепления по А. Для фрагмен вции по гю аткам пурин» используется лабильность Н -гликозиднои связи пури л р С ро .> лой среде. ДНК под. аер ае ся к(иткои(мме ной обрибо «е мур аьинпи кислпто, к ре ультате которэи часть пурииовык основании удаляетси, полинук еотиднви цепь затем расщепляется по образующимся дезоксирибоэны остаткам под деист«нем пиперидинк Из модельною ол щну> теотида при этом должны образощтьс» с едуюцше е мыс совки«енин "Р, П('Рг,-т С (Р>.
П(ттРО-1-С т Л С„'> П(* РО т С >.А-С-ОР>, ((' „О ! С 1 А С С О С ГР!. и("РО. ' С-т л.С -О-О-( -С -(.тр> О СН сн, 1 ! :Щ>-- О К ан. й к-о..г — с сн. — к-о — к — о--сн, "Р О '% О О-К н О сн„акасн, И кк . о"-г--с-'-сн. к-к» К вЂ” Π— Р— О-Сн Н СН,,СН "О О ', ф О О- К'К сн 3~ к-о †к †о . - н,а -.
"Э ан К 4"~;О ~9 — к - о — к — О-СН,— С<ОН~ — СН= сН-Сн=н ~ он КК . О. -Р-О к СН;=С вЂ” СН--СН вЂ” СН= МД 1; сн с сн '-сн — сн.-н о о-й'с а - о — е — с сн. '~ 1) ! о ~! нн ) к.-о — ~ — с сн,, ~ нн: Й С~~ н ~О -н,нсонн 1~ й.-о — н — о — сн,он о . н =-сн 1...,.Е О н -о — ~-.о — сн с<он] — он=он — он=( ) :н - о-е — о. сн.*=-с — сн=сн — сн=нД сн с — он=он — сн н ) .г.Ь с-о — ~~--о — сн, о о и;.нсх .»«н ю и«н 6 о ~ — о- сн-*он у-з а~он=и~ ) с., В.
Расгцепление по цнтозииу осущест»ляетс» ющразином при высокой «онцентрации НаС! с последуюшен обработкой п)юдукъгэ модификвцим пи эридано (рмс. 182), что приводит к образо««нищ слсдующмх олип нуклеотидоаг 325 С ро ну е озьк ело Г. для опреде енн» попадания тимидин» попользуется депз«шцмэ по остаткам пирнмидиноа, длз чего ДНК последовательно пбрэбатыэаетс» гииразинпм ирн низкой концентрации НаС1, а затем пипсридином. Из модельного олигонуклеотида при игом, «Шгм соединений, приведенных вмше, долмиы образоваться: Д(' рпр), Д( ош — à — Ссб Э( »О — à — С вЂ” 1-Л вЂ” С вЂ” Π— О-С -С-Лр) Пролукты всех четырех реакций наносят э соседние лунки поиакриламиднапз тел», разделяют злектрофорехом и радиоаэтографируют.
дна из результатое, схематически представленных н» рисунке 183, приводит к следуззщим е аам: самый «короткин» фрагмент (фосфат) иагюдится в ииюнках О и Л г О и, вероятно, образо»ален а результате расшсплеиия по гуаиозину; наличие полосы я «опон«с Т Е С и ее отсутствие в кплонке С саилетслс .гз)тт о том, что это продукт расщепления гю гнмидину) следам ицет олнгонуглсотид, присугстеуюший и е колоиае С, и э «олонке Т-1-С. т.
е, получивши»он в результате расы пленил по цито«пну. Затем пп подан, ности распоп«с«юге» продуктм а колонке Т -1- С (но не в С), А ф О (но не в О) с прололгкан этот «нализ, »»остап«»пинаем структуру искадного алипшуклеошда. В прилолгеими к реальным по инуклеотндам метод дает «самом»ость прочесть+ взследоеательиоеть ханша 200 иуклеотидиых звеньев на одним геле. Прзблемой, «оторую шпклы» раз приходится решать прн использовании метода Макс«ма — Гилберта, является получение полину леатидоа, меченных толы о по одному нз «онцоа. Обычно лля анализа используются дхухцепочечнме фрагменты ДНК (например, обрвзозаашиеся после расщепления рестриктазами), а есе методы в«едения капиевых меток приводят к образованию фр»гментоа, меченных по даум 5'- или дзум 3' «онцам.
Поэтому прнкпдится прибегать к пополни ельным операциям, аким, «ак разделение комплсментарных цепей ДНК после «веденин метки. Ме од дНК-полнмеразного папи ро«амия в присутствии терминируюгцик аналого« трифосфатоа (метод Сенгсра). Этим методом чаще »сего внэ напру«моя фрагтчентм ДНК, «лонирошнные з одноцепочечнмк фата«, «от» э настоящее время разр«бота»и эяризнты, применммые и к двухи почечным ДНК.
При этом исследуется не сам фрагмент, а комплемент«риал ему ДНК, которая синтезируется с помощью ДНК-полимеразы в услпаиях, приводящих к набору прпдуктов разной длины, соцерк ашик одинаковый 5пконцсно» участок. а и П(ппц-ГП). П(чпо-Г-С-1-ЛР). Д(:,О..)-С-)-Л-С-О-С,), п(срп-г — с-1-л-с — О-О-срК э(срО-1-с-1-*-с-О-Π— с-с — л- г-лр) ВП рС вЂ” Г-С-1-Л-С-О-О-С-С вЂ” А — Г-Л-Сп) 3'.конце — звень» опреле енногп типа ! А, О, С или Т). Дл» юлуче иия такою набора фрагмснтоа «смеси етырек природнык дево си рибонуклсозил рифосфато», используемых ДНК.поли ера.ой дл» синтеза опии,добавляюттрифо фа аналога т гоиуклеотида, оторый ясегютсльио иметь а «ачеств» 3' концевог звена. Этот инвлог отличае ся пт соп вез ствующега природною уйстрата лишь строением углевод« го «омгю сита.
что по м лает ДНК-пол мер»за в лючать ещ к цепь, но ие ивет возмпмности присоедин» ь после дующнезвенья Чаще»сего»качеств«таких тер и ирующ хана ооа использукн трифосфгты 223«д»лез кс нуюмозил а. Так, для получени» набора фра ментов, канч щю ни ся тимидином, в смесь для полимериз ци д:бавл»ют 223'-д дсзощи и ндинтрифосфат: дл» Врыв» и аденозину 223'дидезоксиаде озинтрифпсфат и т л.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
