Ю.А. Овчинников - Биоорганическая химия (1128694), страница 52
Текст из файла (страница 52)
Поскольку требошнне перекрывания пр»- хоцитсн сочетать с пеобкодниостью получения с!жанительно небольших фрагментам инагдч прнменяетси расщепление несколь к рсстр кцноннымн энаовук вазами сдгювременио. При этом необязательно у танавлмвать полную но .леда атсльпп ть фрагментов «ажио лишь найти «перекрыт я . Прошсс поиска оерекры«ающихса блоков июбрзжается спеннальнымн схемами, «ак по катано на рисунке !76. т з! иран то! Вр! ййгй мр и ар! ,. Ф'.
тм ° Ф ' ~~ вю' ар ц т ч! ° --Ф и Ф Шрагме тм ДНК условно обозначены прямоугольникам», верх- иия сторона каторык представляет собой одну «омплементарную '3 непь, а ни!княн сторон» - другую. Слева указаны эндонуклеазы, 'е использованные дли получения оерекрываюшихс» блоков. Вверху дана рестрикпионнаи карта определяемого фрагмента. Стрел«вин а прямоуюльниках указивает.е длин« расшифровангюсо участка „„, >тт п и «вправление, в «о оро определялась последоштельиасть зв данном случае ои» определялась в направлении от бц к 3'-концу! а Рнк Рн * т А Т Т, ! -О-тьс — О-А — с-О -с с-с — А-ц- А — с-с-А-с-с-с- ть- О А А-с-с с-с с-с-сс-Алзс цдса Как вндно на схеме, устанпвлегпще ггослелоаательнасти пплнастмо перекрываются; более тщп, анн определены фактнческн Южжаы ..
Лля верхней ценя н незавнснмо дтя нижней: это слу кят гарантией прав»льностн определена» до»ной структуры н назволяет нзбежэ ь ошибок. Другой способ получення перекрываюгднхся блоков предполагает гмполнае расщепленне Псслецуемого фрагмента (в чвстностн. прн взмощн РНаз).
Нрнмер определенна паслежзвателыкжтн анбаолнгояуклеотнла таким методвч нзабрагкен щ рнсунке (77. Неп нище расщдоленяя нспользуютсн н в случае установлен»я пюледоаательнастн ДНК. Дл» этой целы окгет быть орнменена обработка как рестрикционнымн эндонуклеазамн, так н неспецнфичнммн эвлонуклеазамн (напрнмер, ДНазой ! в прнсутств» канав Ма' ' ).
Онрелеленне страеннн,алнгаяукгагвидо» Во в:ех современник свпсабах апре»слепя» перанчгюн структуры нукленновмх кислот первосыпенную раль нгржот ме оды введения радноактнвнык меток а 5'- и 3'-концевые звень» Чаще всего роль каннской меткн играет фосфатная группа, спдержащвя "'Р, на нвагдэ в «ачестве метки используют также трнтнй (гН) нлн нод ('гзн.
Для в еденн» мечеьщк фос4втных групп в 5'-концевые звенья алнго. н полннуклеотнда» попользуется ферме!а полннуклеатндкнназа (см. с 353Н радновкзнаным реэгентам служнт ЛТР, содеркющкй меченый фосфо(г а у"пола»саня ( зр(грд) Ну лн поныв нислотм В Вг В, О О О О-'в — Π— Р— Π— Р— Π— СН л ,)! н ОН ОН ОН ОН Методы включеннн метки в 3'-концевые группы более разнообразны. Твк, а «вухцепочечные ДНК метка вводятся в составе (п-з Р! -дезпкснр.бону леозндтрнфх4нпаа с помон(ью ДНК-пплнмеразм ! Е сой нлн фага Та (см с. 348). Двух- и олноцепачечные ДНК ьквуг бмг чм ы по 3" концевому звен) с нснальзованнем концевой грклещнднлтрансферазы.
В одном нз варнанюв этого метода к 3'-ОН-группе алнгплеэокснрибонуклеотндв прнсоеднннютсн (а-' Р(-мечевые рнбонуклеозндтр»4юсфаты. После 4жрментатн»- най реакцнн яродукт подвер »ется ще очному гид(юлнзу, в резуль. гаге чего на 3'-конце обрвзуетс» только одно ряба»уклеотнлнгм каска.
Во втором способе спальзуютс» аналапг прнролных нук- ., леозидтрифосфатов, ие содержащие 3'-ОН-группы. Такие апклопг могут быль в слепы в 3'-каине ж завив слцголуклеотада, ио ие способны прясоедипвть к себе последующие звенья, мытому их гжзывают термяиврующими. Обычгю лля этих целей примак ютс» «ордвцспиптрифосфат или 2',3'-дидезоксииуклеозидтрифосфаты. спдерлщшие 1о-лгр1-и кую фосфатиую группу: Строе е укле иоамх к лот О О О 3 11 — Π— Р— Π— Р— Π— ггр — Π— СН. Н ОН г,зо-дл ч же в 3 Введеиие в уцкоццеапе зеегю РНК 3',5цдифосфвтов., мечеяимк ' Р по 5'-фосфатиой рупие. может быль осуществлено с помощью Рнк лигазы, присоедиияющей субстрат к 3' ОН-группе.
3'-Кокса Рнк может быть марки!ющи сакли: тр кием с помовгью химиче сках мецщов: окислецие периодатом и воссгаиовлепием бортритидом иатрия. При этом исцользуетс» РН К, пе содержащая Зцфосфатиой группы. Необхолямым составиым эщмеггп» аиалпэа иукльотигоюй ппслсдовательпости во миогих случаях валке ма определеиие «ац- Вк В В В: Π— пр О Н О дц П Р вЂ” О 1 О !1 Р— О ! О 1! Р— О 1 О О О О 1! 6 11 — Π— Р— Π— Р— Π— тр — Π— СН: Ц В, В, В, В, л ,"1„,; НО о.
Сг- о он ':4' н б он 5~ он О -Π— Р .Π— Р -О о о цевых групп. Эта дастмгветсв введением метки (5'- нл уц( гр(- фосймта( в 5'- н 3'-канцевме звеньн олиго- нли полниукмютидов с последую цнм фермент»тнвнмм гидролизом до егютветствующих нукщозндмоиофасфзта» После рвзделанни продуктов гидролиэв иде гнфнцируютсе меченые концевые зв«нь». ((ля определения первичной струкгурь «ор тки» олнгоиуылеотидов (до (5 — 20 зве ьеи) обмчгю используют пл! блумтрдкгидго лгпнл, илн сэлггрлриита .
5(ечеиими по однпму нз кангюв алиса ° уьлео ил гндролнзуетсн э»вану«пеевой с лратцвоноламнаю конца условиях «епалгю а рвсшеалеи я, твк чта обр»вустел и»бор всех возм нмх фрагмента» Прн расгюло «мнн получен«их таким путем олнгоиуклсотидов в порядке еазрвствнин длиим камдме дев соседних продукте будут отличаться друг от друге нэ одна «вице все звено, Меченое ме звено у всех алищнуклеатилов »ел»ется общ м (рнс. (уй(.
Совер сино очевнд ю. что если рвзпелнтыка получен«не олиюнуклеотнл и лл к»»дога из ннх о~ ределнть концевое звено, прас»и»юла»ми геченому, а после рве»о»олени» в«их фрв е тав в порядке вохр»стени» дуням мазкно реконструир икть последонвтельность походного плнпзнуклеотид» Таким обрезом, проблс а э»ключа«те» в разделении продуктов н ндегпнфнкэцин нх «он Мвмх ' ру'" ' гоп -А-т-С-т-т-С-А — П-т-А Есл сравнивать подан «но ть л ,ю . г укл г рн элсктрпфорезе . пода жностью получаемого из ае о пролукте. укорочен ншп па одно звсгю, го наблюаанггся следующие закон ж ерностн отщеплеиие рТ нриводнт к у еньшенню полнил иост«продутктв и срез е ю с схшсным отншгок мотивом жледствнс резкою уменьшения заряда. Опцеп сине рС выз щст качественно такой е о ол е, асино меньший эффект. О щепленнс рА, умень пая дзину о нгонуклеознвл и в знак телыю меньшей .тепе и ПЮ рвапся«Ю С рТ И рб! Юрик При»вднх НСХОЮр Му ущЛИЧЕНИЮ одни «ност .
Наконец, отшсг лен с рС очень йвло меняет варил, ио резко умен вет длину,;то сушеспм но увелпчинае под»и но ть провукта. При и окроматцафни рвзл ение ор неко.ги со т . твин со с сдуюшнмн вам номер ости н: чем больше длина олн онткле пила, тем о менее пог внн ен. так что кеяаыс лвв соседних нит прелсгавляют собой олиго у леотицы, огзнчекгпшшя м ши г у в г и пури оною пу«леотиве, тп ра.
тояннс селу ними по всргика н больше, чем прн тщеплепнн пирнмидинового нуклеотнда. В «чесмы р мера рассмотр и агюлгл ралноавтограммы. прннсдс нои на р сунке !7Ч. Очевиано что наи енес подвижный прн ~омахр ма аграфии «омпонент представляет боп схолн поли онуклеспил. Со ед нй с ним продукт обрвзуе .я путем отшеплени 3' «охнем о звена при злектрофгрезе поднигкность его слегка увеличивается, а прн гомохщгмвтографин резко возрастает. Отсюда делаетс» вы од, тоотгцепленным зшном явлвет я А Сящую щнн цролукг (3> отлнчветс» от р дукта (23 также од им звеном Он значительно менее подвижен прн эле трогйорезс и нес аль«о более иллан» ен нрн гомо«ром«ты раф~ и. сщшватсхьно, (33 образуется из (2) в дезу. ьтете отшепленин 3 1!родолжан тако а влит, преп лют звена.
кот рмм п|н ает и вру от лру в хв»дая наро ° о един« и«ген, т.. «о п ждого ояигонуклеотицв с ес . Чита»» этн о Меме ну леатнды, мож о мзсста «таить исходную послшшмпельность. Используемые в методе Еду»вашего пати»» пра ила шм» и предста лени в рамке на рисунке 179. Отшепление Т резкп у ень вет падая «ность пр электрофпрезе н малп увеличивает прн гомохр матографн». Отшспленне О нез вчнтсльно уменьшает дви ностьпри влек. трофорсзе и илыю уее и ищет пГ и ро пнрафнн. Отшеплсние Л вечна нтельно уеелнч ва т дви ь ярн эле трофор с н н.зьно при гомокроматогрвфии О щенленне С сильно увслич ивет полни кно.ть ~ рн э: е трофорезе и незначительно орн о окроматогрлфин.
С замошью метода *блуждающего ламм мо ут определяться оо ледовательности алиго ук еотнцож сощржаших ло 20 звеньев. Одним з на более кушестееннык ег не т явля п.я недостоверность опревс гю вук нл р звеньев соседних с мечены зщ ы Соаремеинмс методы определения послезювательнпсти фрам«си. тов нуклеиновых кислОт о иоанны на одном общем принципе. Этот цр нцнп заключает в р в ~ ллн зможных «лицевых орзлукто, полученных нэ исходного полимер» таким пбрнзом, что все они имеют на олпом конем одну и гу кс последовательность, а на пру~ам пцнн н пп хе ну леотиа.
Ну а ноаыа кнс огьг г мрС ф з')цтл 41"" -т .С фмрадт -' Ослтютсд ' фзАтстт 'ралтсттсдфт -А , )гСЛ-.СТГСАфтд ~ ф~ , 3 В табл»не (2 представлены наборы концевых процуктов разной — ванн, нмеющн одно н то гке 5' концевое звено (С), л оканчнеающнхс» аленозином (колонка А), гуапознно (ко окка 6). цнтнднном (колонка С) нли гн нднном (колпак» Т). В колонке А мходнтся пентануклеОтнд, ундека- н трндекануклеот\щ Олнны кОторых совладаютс пололмннсмА в»сходном палннуюмотндс. Лнало нч ю г в колонке С длин фрагментов (трн-, секса., гюна-, декан тстрэдек»- н пентвдска-) соответствуют положению С в »сходном уклеозмдс. То же справедливо ллн соединений. Оканчнеаювщхс» С н Т.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
