Ю.А. Овчинников - Биоорганическая химия (1128694), страница 51
Текст из файла (страница 51)
д. Этн ферменты яаляютсп компонентами стемы рестрикции— мОлиф «ац прокариозич ских «л ток, которая предназначена для нк зап(иты от чум родных ДИК. К рестр кпиопным анлонуклеазам атносятс» -ак е и ас Лруги ферменты, «п циф геохи рвсшепляющие ДНК по опредешиной пштпловател~носпг, хотя часто их роль в процессак рестрикции модификации не доказана. В зависимости от характера >знаю«мой нукл от»дно» послспова. тел ости ( с«эта ), м«ст раси(епл нпя и условий реакции ре отри«тазы д лятся на три класса.
Р стрн циовныс нлонуклсазы перво о класса узнают спецнфнчесхую последовательность ДНК но рас цепляют нукле новую кислоту в разли ни«местах,находяшнкся иа неопределенном расстояния от уч» тка уэна ни я.(>ни садер ат в одном ферг енгном компл кое рсстриктнрукхную и модифнц рующую активно ти н требук присутств л в .Рсдс 5-аденоз лметиоиипа, ДТР н Мй'' Ферме ро а ра щ пляю у а ток ДНК, имекмг й ось симме рии вп рого порядка К н м относится так п сколь О ферментов, узнающих н снм мтр» ы п слелошт л «о и рас шепляюшик ДНК на н «егором расстоянии От у юстк» узн«квин».
Общ м св йетаом рестрнщаз этого класса является и«обходи ость С роек е ук ан юыь с ог угп присутствия в ср де только онов Мг'*. некоторьм рестр «тазы рве цецтяют полинук.з ппгднуго цепь твк, что в результате образу«пел фрагменты. солержащпе нк 5'-«лицах высгушюнще штыре«э«чины фрагмегпм с фосфорилирошннымн 5' концевыми ю "ньпми. Вел дст не симметрии раси!сил» мой гюг допатсльнагт : т етрануклеотидм «омпшмеитврны друг лругу.
Они на гышют я липкими, так нэк могут взаимо» йстаовать друг с друшм. »бразуя соверш нные двуспиральны участки. Друпе рестрнктазы этого класса расщепляют цолинуклегпндную ц пь с образованием фрагм нтое, «е содер аших олионнтевых «онц пмх у ~котков. иг н структур с высшггаюггшмгг уьконцсвыми одноннтевыми участками. а н! ! Орз пг! С! Сп И! Ормр... .Мфгф + ,.цмрС»ср(рлрсш 5' рцрбрбрлрт»СРСРИР .. 3' ...рирсрсртрлрппсрмр... е н! Длп рес риктаэ тр тыго «ласса участок уз авания не обнза.
тельно дол;к н быть с мм три«ни . а расшеп~ение проискодит иа расстоянии 24 - 27 нуклеот лпвоту ~аст«а узнашни». Тек ж кан рестриктазм вервогп шпссв, онн содержат в одном комплекс«и рестрикт руюцую. н метилируюшую акт вности требуют ллн рестрнкци присутстпияЛТР.Прихмрпоследоштелыюстшузиаваемон рестриктаэой ВсоК!. относящейся к тршьему «лассу, привед и н «т 5 йф»СС (Иу„„ Известно у е иескольно сотен рестриктаз.
Часто выл лпе из разных источников бярменпл проз«лают одинаковую .пецифичнпсть Такие ферменты называют изошиюмерамн. Дезоксирибону л азы ! н П (ДНазм ! и П!. дезоксирнбонуклеазу (, или панкр атическуюдезаксирибоиукл азу. выделяют из поджелудочной ж л зы крупного рощино скат» О а расщепляет одно- н двухцепочечиые Д Н К. лапая сложную смесь ка« моно-, так и олнщиуклсютидовс 5'-концам . с л р клшими фосфптиьм группы. Фермент »роне»» т активность а присутствии онов Мйг нли Ми« ' при оптимальном энач нии рН среды 7,5. ДНаза ! и«специфична к посл довательиости субстрата, однако маблюдаютс» неэначит льны различия в скаростяк раса пл. к я фосфодиэфирньж связей, образуемых различными пук еотидами. Дезоксирибоиуклеаэа П гидролизует ДНК до смеси мапо- и олигонуклеотидов, содержащих 3'-фосфатные группы, оптимум рН ферм ита лежи в кислой области.
ДНаэы ! н П испольэуяпсн длн расщепл ния ДНК с ц лью получения «орет«их фрапле тов Экзоиуклеаза 1И э Е с 1к Фермег штализирует последовательное уделе»ив 3'-концевых звсиьев «з лвухцепочсчимх ДНК путем отшеплеиия их в аиде 5'-моиоиуьлеатидов Пр ДНК э л цы с 5*- ппа уч т пглролиз ородол:кается до те» пор. пока длина двухпецочечкого участка в центре гидрслизу»мои молекулы ие уменьшается иастольго.
что шш 5'-коицевих фрагмента болысе ие могут ул рмч ваться вместе. Когда они разделяются, гидролиз остап»вливается Экзоиуклеаз» 1И используетс» дл» укорачи аим» двухцсцочечнмх фрагмегпов ДНК. 5'Экза уклеаэа иэ Е. со1г, инфицированной бактеришфа~ом Е Фермент удаляет иукжозид-5'-фосфаты, последоиательио отщепляя их пт 5'-конца лвукцепочечимх ДНК.
В ре- куль»ив образуются ДНК с выступающими 3'-концевыми участ. кеми. Э к за кукле еэа УИ из Е. со1~ специфична «адиоцеео чечпмм ДНК и отщепляет небольшие алисоиуклеотидм как с 5'ч и с 3'- ДНК. Приме»спи»и»ходит» экво »уклееза 1 из Е.со!г, гд. ролизующаэ одипцспочечиые ДНК в 40 СЮО раэ быстрее, чем двух С ЫИ»й Х И 1р. ШЗЦ. .в лре,~ 1 Нунленнааые »слог О б Π— à — ΠΠ ΠΠ— Š— ΠΠΠР— О О т 'Й О Р вЂ” О ! О О О О О О Ом Πà — О О Прн более высоких нонцентрацинк РНазы циклофасфатнме группы раскрываются, образуя 3'-фосфатные групнм. Процесс раскрыпгя цнклофосфатов ожет быль осуществлен кратковременной обработ«о» «не«отой: при этом обре«уюте» смет» 2'- н Зц ыоггофссфзтов Такие рибонуклеазы отнесятс» к эндонуклеазам.
Р н 6 и ну к л е а за Л специфически гндролнзует РНК по ёнрнмндиноеым основаниям( «онечнммн пропуктами (опеле (мс. шевлення циклофосфатов) явлнюгс» пнрнмивиновме нуклеозид-3'- бюсфеты н олишиуклеотиды, содержащие 5'-ОН- и 3'-бюсфатиую группы: цепочечные. Г«щюлизу подзергаюгса только цел»меры со свободной 3'-г«дрещнльгюй группой; в результате гилролнза ДНК укорачивается с 3'-конц«путем последовательного отша«ленин иуклеознд-5' фосфатов. Фермент нспольэуетсп для специфического удалеви» 3'-концевых однацепочечных участков ДНК.
Олелует птметнть, что в «тезках содержится большие конине .тво дезокснрибонунлевз, рвсшепляюгцих ДНК «ек по экзоч твк н пп з допуклеазному типу только в присутствии ЛТР. Мгюгие нз нн» принимают участие е процессел рекомбинации. Ферменты. Расщспевюшие РНК. Болышпктво известимх рнбонуклеаз (РНаз( относится «классу фосфотрансферзз — ферме»- он, «а авнзируюшик нуклеофнльную атаку 2с,ОН- руп рнбозы а ато фосфора фосфоднэфирной свизн. В результате на нерва этапе реакци» образуются олнгонуклеотиды, содержащие 2',3'-циклофосфат иа 3'-кенце и ну«лебезил-2',3'миююфосфаты р Ар О рцр Ср О РАРОР Ор Ор Ор Ср А Строев еггу ле новьк н пег РАРОРСРС .р Г ОР ° АРСРО .р ~ О .
р Г СР С '"р А РАРОРОРСР ОР Г АРОРОРЧ ОР ОР~Р Ь А Скорость |нющеоленн н различны к фосфоднэфнрнык связей убывает раду СРА-. Орл Д СРС:Г ОРС- СРО- Гуртзг нрьлп щлролнзуются адгюннтевме РНК. р ибо нуклеаза Т, нз Аьрсгщйнз огухае осуществляет расщепленне РНК пп гуана оным звеньем, образуя гуанознц.З'- фосфаты н алнгонуклеотнлы, нменнцне на 5'-кпнце гндрокснльную тру пу, в на 3'-кончак гуанознн.у'-фосфат. н Знмь ! дымы ~р. Нэай РАРЭ РОРСРОРАРОР ОРОГт; р СРА РАРО р Г г- .-р - СРОРАРО Р ГГРОРО р СРА РДРС Р:С, Р СРОРАРС, Р ~ ОРОГО Р СРА Та» гке «вк н рнбонуклеаэа А. РНаза Т, со значнтельно болывей Ратью расщепл» дноцепочеч ые оолннуклеоткдыг скорость гнлролнэа убывает в ряду ОРС" Срл ~брб СРО Ф' Рябо»ух»еаза Т, нз Л. огутае цр» длнтель ом пдролнзе РНК расщепляет ее полностью до нуклеознд-3'.Фосфатов Прн части ном расщеплен н РНК обрнзуются преимуществе» о фрак>мнем, годер:кашне на 3' каппах аде>юзнн-3'-фосфат.
Р »бону клев за Рд нз Озп1»йо зрЬ»егодепа пренмущест. венно ресще лнет фосфоднэф рные свнзн, а которых донором 3'-ОИ. Руаны являютсн пурнновме уклео>ндм, т. е. связи ЕРН; скпро.ть расщеплепня возрастает в ряду О ' С < С Л. Сре>,н цругн ф«р сытое. Расщецляющнк РНК, следует уцо к. утьрнба пук лев зу УН нз Е. сощ проявляющую вбсалюпум спецнф»ч>юсть к двум»почечным по. нр бо уклеотндвм.
Фермендает олпгонуклеатмды, оканчнеаюшн ся 3' Ьосф а Ферменты. Рвсщеплвюшме ЕНК н РНК. Извес ю значитель се число фсрменюп, неспецнфичнык к т оу углевоц ог остатка в нуклеиновых кн лотах. Так. бюсф днэстераз, выделяемые из «да змей„ >ндролнчуют олнго- н пол»нуклеотиды начнная с 3'-конца, путем пп.ледо ательного атщеплення нуклеознд-5'-фосфа ов Этн фер е>мы способны катклнзнровать гидр лнзод пце очечнмх н со значнтельяо мепьшен скоростью двуспнральнмк палннуклептндов. Напротив.
фосфоднэстеразы нз селезенкн гндролнэуюг нукле»новые к»слеты начи ая с 5'-конца, ооследомюельна удаляя кон и е звенья в анде нукле з д-3'-ф фэ Об ф р >ц *у рибоч дезокснрнбоч аппп - н полнпуклеотнды н попользуются для получения мо>юнуклеотндо» Вплывая рупца фср ен оа, неспацнфнчнык к типу у>лекодпо>о тка,шсьмв уествнтель>щ к вторично» структуре н расшеплнет только одпоцепочечныеполннуклеотндм.Н»нболее юнро о нснользуе мн ферментам» такого типа ввляютс» нуклевз* 5, нз Л.огухае, пук»еаза нз Мц В Ьееп н уклеаза нз Н. став>а.
Первые дее нз ннх расщепляют одноцепочечные дНК н РНК в слабокн лок ред а прп у станы ио о» цинка до плнго-н мпн пуклеотндовс фосфвтной группой на 5'-конце; третья ра щепляет пол»нуклеотиды в центральной п слабоосновной средах, лакая 5чф сфорнлнрован ные коро екпс олн онукм:отнды. Этн нуклеазм шмроко используются лля нсследощннн вшрнч ной структуры од>юцепочечных участков В гсннон ннмепернн онн прпмсняюшя лля удалеяия ол>юннтепмх конпевмк участков днк Существует болыное число ферментов, способнмк отщеплять фосфатные группы от моноч окнш- н полн нуклеотн> ов. Нещ>торпа нз ннк обладают спецнфнчностью в том отношсннн, чп> удаляют только 5'.
нлн только 3'-фосфатные группы. Из еспецифнчных фосфомо>юэстераз, от>цепляю цнк фосфаты ене завнсн осгн от нх поло «сняв как от монпз твк и от полнпуклеотнаоц и ирака н пользуются дее фосфомоноэстеразы. Од>м нз ннх, так азываемая бактернэ.п на» щелоч>пя фосфатвза, выделнетсв нз Е.
соЬ, другвянз тонкого кншечннка телят. В блочном методе определенна цоследоввтельпштн нуклеиновык кислот весьма сушестшнна мета»ело>м» структурного анализ». Волно нз возмо>кнмх варнантов попользуется полное расщеплен»с ~олипуклеотндной цепн двумя (нлн более! фер ентамн с рвзлнчном спецнфнчностью. В случае РНК это ожет бь ть осуществлено разлнчнымн рнбонуклевзамн, например гндролнэ последоеате но рнбонуклеаюн То а затем папкревтнческой рнбопуклеазой С>рук>урн полу мяных олнгонуклеотндов сравннваютсн для пон «а перекрываюшнкся последователь»>ятей Есля этп пказываетса недостаточным, попользуется третин РНаза. Д я двухцепочечных ДНК перекрмвающнеся блокн получаютс» путем расщенлення дву я нлн более раэл чнимн ресгрнкцнош>ым» з шояуклеаза Прн зтам часть нсслелуемоп ДНК >ндролнзуется одын фер ен ом н усчвнввлнвается структура получен ых фраг- ментов, в затем те же операм н повторюотся а другой порции ДПК с лрупгм фермегпом.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
