И.П. Ашмарин, А.А. Каменский, Г.С. Сухова - Руководство к практическим занятия по физиологии человека и животных (1128356), страница 42
Текст из файла (страница 42)
Метод рекальцификации плазмы. 0,1 мл плазмы в течение 1 мин .прогревают на водяной бане при 37'С, затем добавляют 0,1 мл 0,025 М СаС1, и регистрируют по секундомеру время свертывания. Сравнивают время до образования сгустка в опытной и контрольной группах. Часть И. Практйческие задачи по патофизиологии 214 Таблица 1 Пример обработки средних данных тромбоэластограммы ('р<0,02) Далее студенты осваивают методы анализа фибринолитической системы А'.од оиределения К 4 мл дистиллированной воды,.разлитой в пробирки Сали и подкисленной до рН 5,2 0,075 мл 1%-го раствора уксусной кисло- 3. Определение фибринолитической активности (ФА) плазмы по времени лизиса сгустка эуглобулинов Метод определения ФА эуглобулинов плазмы впервые был разработан в 1950 г. Коваржиком и Булуком.
Ковальский с соавторами применил этот метод для определения фибринолитической активности плазмы человека при различной патологии, считая его ценным клиническим тестом, особенно для сравнительных исследований фибринолитической системы больших групп пациентов. Известно, что эуглобулиновая фракция содержит плазминоген, а также его активаторы, фибриноген и ряд факторов свертывания крови.
Метод основан на способности фибринолитических ферментов эуглобулиновой фракции, получаемой из плазмы крови при рН 5.2, лизировать сгусток. Время лизиса сгустка характеризует активность присутствующих ферментов. Посуда и оборудование. Пробирки Сали; пипетки на 0,1; 0,2; 1,0; 5,0 мл; водяная баня на 37'С; центрифуга на 2000 об/мин. Реактивы: 1) цитратная плазма крови; 2) 1%-й раствор уксусной кислоты; 3) боратно-солевой раствор: 9 г ХаС1 и 1 г Ха,ВО, 10Н,О в 1 л дистиллированной воды; 4) 0,025 М раствор СаС1, Тема 1У. Патофизиология гемостаза 215 ты, добавляют 0,25 мл испытуемой плазмы. Смесь осторожно перемешивают покачиванием пробирки, инкубируют 10 мин при комнатной температуре и центрифугируют 7 мин при 2000 об/мин.
Надосадочную жидкость сливают, пробирку опрокидывают на фильтровальную бумагу и жидкость с края пробирки удаляют фильтровальной бумагой. Осадок растворяют в 0,25 мл боратносолевого раствора. Далее определение ФА эуглобулинов проводят одновременно на фибриновых пластинах и по времени лизиса сгустка. Для этого на фибриновые пластины (прогретые и непрогретые) наносят по 0,03 мл раствора и измеряют зону лизиса через 18 — 24 ч инкубации при 37'С. К оставшемуся раствору эуглобулиновой фракции добавляет равное количество 0,025М СаС1, и пробирку со смесью немедленно ставят на водяную баню при 37'С. Интервал от времени образования сгустка до его полного растворения считают временем лизиса сгустка.
Необходимо помнить, что во время инкубации пробирку со сгустком нельзя встряхивать. Время лизиса сгустка выражают в минутах. Нормальные величины времени лизиса эуглобулинов для крысы обычно составляют 60— 80 мин. Сопоставляют время растворения сгустка у опытных и контрольных крыс и делают вывод об изменении фибринолитической активности при аудиогенном стрессе.
4. Определение фибринолитической активности на стандартных фибриновых пластинах и активности активатора плазминогена' по методу Аструпа — Мюллертца Метод определения ФА плазмы на стандартных фибриновых пластинках был предложен Аструпом и Мюллертцем (Алагир, Мо11ег~з,1952). Этот метод нашел широкое применение благодаря тому, что он прост, легко воспроизводим, дает хорошую повторяемость результатов, не требует сложной аппаратуры. Принцип заключается в том, что исследуемая жидкость, нанесенная на стандартный слой фибрина, вызывает его лизис вследствие действия присутствующих в ней активных ферментов - плазмина и активатора плазминогена.
Посуда и оборудование. Чашки Петри диаметром 9,5 см; пипетки; центрифужные пробирки; цилиндр; коническая колба; штатив для пробирок; столик с ровной поверхностью; лабораторные весы; термостат на 37 С; термостат, регулируемый на 86'С. Реактивы. Бычий фибриногеи. Готовят 0,3%-й раствор (по белку) в 0,85%-м 1ЧаС1. При взвешивании сухого фибриногена необходимо учитывать весовое соотношение белка и буферных солей, которое указано в сопроводительной инструкции и варьирует от серии к серии. Например, если в инструкции указано, что на 1 г белка приходится 1,9 г буферных солей, то для приготовления 216 Часть 11.
Практические задачи по патофизиологии 0,3% раствора 870 мг коммерческого препарата фибриногена растворяют в 100 мл 0,85%-го ХаС1. Бычий тромбин. Готовят раствор тромбина в 0,85%-м 1ЧаС1 с активностью 8 — 10 с (при смешении 0,2 мл приготовленного тром- бина с 0,2 мл плазмы крысы образование сгустка происходит за 8 — 10 с).
Если тромбин содержит 2000 единиц активности на 0,2 г сухого веса препарата, то раствор готовят из расчета 2 мг/мл 0,85%- го 1ЧаС1. Активность каждой серии препарата тромбина указана в инструкции. Приготовление фибриновых пластин. Взвешенный фибриноген осторожно высыпают в определенный обьем 0,85%-го ХаС1 и ставят колбу в термостат на 37 С. Растворение идет в течение 1 ч при периодическом очень легком встряхивании колбы. Помешивать стеклянной тыочкой раствор нельзя! После полного растворения фибриногена 9 мл этого раствора смешивают с 0,2 мл раствора тромбина и быстро выливают на дно чашки Петри. Чашки Петри должны быть установлены на очень ровной поверхности или на специальном столике, поверхность которого выравнивается по уровню.
Фибриноген под действием тромбина превращается в фибрин и застывает тонким ровным слоем. В течение 1 — 1,5 ч чашки Петри выдерживают при комнатной температуре, неплотно прикрыв крышками. Их нельзя трогать, сдвигать, иереставлять, пока не образуется илотная иленка фибрина1 Приготовленные таким образом фибриновые пластинки можно использовать сразу же после застывания или хранить в течение 7 — 10 дней при 4 — 6'С на ровной поверхности. .Внимание~ При заливке чашек Петри необходимо строго следить за тем, чтобы слой фибрина по всей поверхности был одинаковым, не отставал от дна чашки, и не допускать образования пузырьков.
Ход определения Для определения ФА наносят 0,03 мл исследуемой плазмы на поверхность фибриновой пластинки. Крышку чашки выстилают слегка смоченной фильтровальной бумагой и помещают на 24 ч в термостат на 37'С. После этого срока определяют зоны лизиса фибриновой пленки, образовавшиеся под действием фибринолитических ферментов анализируемой плазмы. Площадь зоны лизиса определяют как произведение двух перпендикулярных диаметров (в мм'). Определение активности активатора плазминогена было описано Лассеном (1.аззеп, 1952). Он предложил использовать метод фибриновых пластин для раздельного определения активатора плазминогена и активности фермента, свободного от активатора. Для этого чашки с фибриновой пленкой прогревают в течение Тема 1У. Патофизиология гемостаза 217 30 мин при 86 С.
При этом разрушается плазминоген, который включен в небольших количествах в фибриновую пластинку, и не остается субстрата для действия активатора плазминогена. Далее наносят по О,ОЗ мл исследуемой плазмы на непрогретую фибриновую пластинку и параллельно на прогретую. Время инкубации при 37'С вЂ” 24 ч. По зоне лизиса на прогретой фибриновой пластинке определяют плазминовую активность исследуемой жидкости. По разности площадей зон лизиса на непрогретой и прогретой фибриновых пластинках определяют содержание активатора плазминогена.
Сопоставляют зоны лизиса на прогретых и непрогретых фибриновых пластинках и делают вывод об изменении активатора плазминогена после аудиогенного стресса. 5. Метод определения концентрации фибриногена и фибринолитической активности в малых количествах плазмы Метод позволяет определить количество фибриногена, содержащегося в плазме, и фибринолитическую активность. Метод основан на том, что фибриноген плазмы, нанесенной на хроматографическую бумагу, пропитанную тромбином, быстро превращается в фибрин. Количественно фибрин определяют фотометрически после отмывания с бумаги других белков сыворотки, окрашивания фибрина фуксином и элюции раствором спирта в щелочи.
Количество фибриногена определяют по калибровочной кривой, полученной путем разведения плазмы с известным содержанием фибриногена. Фибринолитическую активность определяют по разности величины фибриногена до и после инкубации проб плазмы, нанесенных на хроматографическую бумагу. Посуда и оборудование. Конические центрифужные и большие химические пробирки; термостат на 37 С; фотоэлектрокалориметр (ФЗК-56М); центрифуга на 2000 об/мин; сетка из капроновой лески; хроматографическая бумага ленинградская "средняя". Реактивы: 1) 0,2%-й раствор кислого фуксина в 50%-м спирте (50 мл 96%- го спирта и 46 мл воды), содержащем 10%-й раствор СН СООН: 500 мг кислого фуксина растворяют в 250 мл 50%-го спирта и приливают 25 ил ледяной уксусной кислоты.
2) 5%-й раствор СН,СООН (5 мл ледяной СН,СООН и 93 мл дистиллированной воды); 3) смесь спирта со щелочью: сливаются равные объемы 0,5 н раствора МаОН и 50%-го спирта; 4) 5 н. раствор Н,БО 1на 1 л раствора добавляют 139 мл концентрированной,ЯО ); 5) мединаловый буфер,р)т 7,4; 6) раствор тромбина с активностью 8 — 12 с, что соответствует 2,0 — 2,5 мг/мл тромбина. Часть 11.
Практические задачи по патофизиологии Определение концентрации фибриногена Хроматографическую бумагу размечают на квадраты размером 4~4 см, делают отметки простым карандашом (число, № пробы) и пропитывают заранее приготовленным раствором тромбина. Пропитанную бумагу оставляют на воздухе для подсушивания при комнатной температуре в течение 5 — 10 мин.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
