И.П. Ашмарин, А.А. Каменский, Г.С. Сухова - Руководство к практическим занятия по физиологии человека и животных (1128356), страница 37
Текст из файла (страница 37)
Существует два метода исследования скорости дыхания митохондрий: 1) гомогенизирование ткани и выделение митохондрий методом центрифугирования и 2) скинирование мышечного во- Часть 11. Практические задачи по патофизиологии Цитоплазматический фа~тор, '«Яф контролирующий каналы пор авив Октамерная креатинкиназа ю Динамерная креатинкиназа ю Адениннуклеотидная транслоказа Канал поры внешней мембраны Рис. 14. Строение митохондриальной мембраны и митохондриальных каналов, формируемых порином локна с помощью сапонина, что делает митохондрии доступными для субстратов.
Первый метод делает наружную мембрану митохондрий более проницаемой для субстанций с молекулярной массой выше б кД благодаря большим порам в этой мембране, формируемым специфическими белками (митохондриальный порин, мол. масса 31 кД). Благодаря применению второго метода в целой мембране, не разрушенной центрифугированием, эти специфические белки связаны с цитоплазматическим(и) протеином, или протеиновыми структурами (фактор *'х"), которые контролируют проницаемость внешней мембраны митохондрий для АДФ.
Таким образом, существуют внутриклеточные цитоплазматические протеины, или протеиновые структуры, которые контролируют проницаемость внешней митохондриальной мембраны ля АДФ в мышечной клетке и ию. При центрифугировании они отделяются от мембраны и остаются в. супернатанте, проницаемость внешней митохондриальной мембраны для АДФ в изолированных митохондриях резко увеличивается, в связи с чем увеличивается уровень максимальной скорости дыхания митохондрий. На схеме, приведенной на рис. 14, показано строение митохондриальной мембраны ~л пю и митохондриальных каналов, формируемых порином и проницаемых для АДФ.
Проницаемость каналов контролируется дополнительно цитоплазматическим фактором х, соединенным с цитоскелетом„но при изолировании митохондрий этот фактор теряется и внешняя мембрана получает абсолютную проницаемость для АДФ. Цель работы, Определить максимальную скорость дыхания митохондрий и дыхательный коэффициент митохондрий в скинированных сапонином скелетных мышечных волокнах. 10. Для проведения полярографических исследований вносят в ваться до 22'С не менее 3 — 5 мин.
11. Открывают компьютерную программу*, пишут название файла, опускают электрод Кларка в раствор оксиграфичес- 12. Добавляют в эту же ячейку мышечные волокна из пробирки № 3 и определяют изменения концентрации кислорода в растворе (не менее 3 мин).
13. Добавляют в ячейку б мкл 50 мм АДФ и повторяют изме~ение. 14. Затем добавляют 9 мг креатина и вновь повторяют измерение. 15. Добавляют еще 6 мкл 500 мМ АДФ и повторяют измерение. 16. Для прекращения записи нажимают клавишу "езс*' и выхо- 17. Выключают иасос водяной бани, а затем магнитную мешал-' ку, вынимают электрод Кларка из оксиграфической ячейки. 18. Ткань из раствора перекладывают на предварительно взвешенную фольгу и помещают на 24 ч в сушильный шкаф (температура 100 С). ' Компьютерная программа разработана А.М.Ивановым (ГНЦ, институт Медико-биологических проблем, РАН). 4.
5. 6. 7. 8. 9. Часть И. Практические задачи по патофизиологии от т.зо1еиз. Мышцу быстро освобождают от соединительной ткани. Переносят 5 — 6 мг мышечной ткани в, заранее приготовлен- ный раствор А (0,5 мл) на часовом стекле. Под бинокуляром на ледяной бане (или холодовых элемен- тах) разделяют пинцетом для электронной микроскопии ткань на пучки мышечных волокон. Помещают пучки волокон в пробирку №2 с 2 мл раствора А и добавляют в нее 40 мкл приготовленного ранее раствора с сапонином (из пробирки №1).
Ставят пробирку № 2 в шейкер для перемешивания на 30 мин в холодильнике (Π— 4 'С). В пробирку с 15 мл раствора Б добавляют 30 мг альбумина, тщательно размешивают и переносят 2 мл этого раствора в пробирку № 3. Сюда же переносят ткань из пробирки № 2. Пробирку № 3 помещают в шейкер в холодильнике для от- мывки от сапонина на 10 мин. оксиграфическую ячейку 3 мл раствора Б. Все свободные оксиграфические ячейки плотно закрывают, включают водяной насос и магнитную мешалку. Раствор должен прогре- кой ячейки и делают калибровочную запись изменения кон- центрации кислорода в растворе Б без ткани.
дят из программы повторным нажатием клавиши "езс" Тема И. Патофизиология сердечно-сосудистой системы 19. Фольгу с тканью взвешивают, рассчитывают вес ткани и определяют, используя компьютерную программу, скорость дыхания митохондрий: 1) в растворе Б (У ); 2) в растворе Б с 50 гпМ АДФ; 3) растворе Б с креатином (%Сг) и 500 мМ АДФ (У ). Рассчитывается скорость дыхания: количество шах О, (нг-атом/мин), поглощенного 1 мг ткани. Растворимость кислорода в растворе Б принимают равной 4бО нг-атом О,/ мин. Если запись производится записывающим устройством на бумажной ленте, необходимо провести вычисления поглощения кислорода на всех отрезках записи (пункты 11 — 15), сделанных в течение 3 мин каждая.
Для этого используют формулу: Ь,(мм) 460(нг-атом О2!мл) 3 мл нг-атом О~/мин мг = А, (мм).3 (мин) Х(мг) где с., — проекция длины наклонной прямой, записанной в течение 3 мин, на ось абсцисс (мм); Е, — ширина всей бумажной- ленты (мм); Х вЂ” вес высушенной ткани (мг). Рекомендуемая литература 1. Гайаго А. Муор1аитпс Ггее са!с1сии сопсепсгас!оп геасйес$ с!пг1~щ сне Ь~!сей оГ ап 1псасс во!асес1 сагйас сеИ апс1 с1цг!п8 са!саги-1пс1с1сес! ге!еазе оГ са1сшгп Ггот йе иагсор!аяп!с гес!си1шп оГ а зЫппес1 сагйас сеИ Ггогп сне гас ог гаЬЬ!с чепсг!с1е//! Сеп РЬуяо1.
1981. 'К 78(5). Р. 457 — 497. 2. РаЫаго А., Гайаго Е Са1си!асог рго8гаиб Гог согпрос1п8 йе согпрояс!оп оГ сне ао1с1с!опт сопса1п1п8 сиса!с!р1е гпеса1в апд 118апдз инес! Гог ехрег1спепЬ 1и зЫппес! пшзс1е сеВ..! РЬуя1о! (Рапи). 1979. У. 75. Р. 463 — 505. 3. 5а1л -КА., Ки~леьом А.К, ес а1. Сопсго1 оГ се11п1аг гезр1гасюп 1п что Ьу п1!сос!юпопа! омсег теи1Ьгапе апд Ьу сгеас!пе Ипате. А пею вресйас!ж Ьуройеяя розяЫе !пюЬеи1епс оГ и1!сос!1опдпа1-сусоМсе1есоп !псегасс!опт//!.Мо1.СеН Сагйо1.
1995. Ч. 27. Р625 — 645. 4. И'еЫег КУ., Киюесго~ А.К, ЮЬаго~ Кб. ес а1. МесосЬопдг!а! гезр1гасогу рагаи1есегь 1п сагйас с1ьые: а поче1 спесЬос1 оГамеыгпепс ояп8 яароп1п-эйпин Г!Ьегь/ / ВюсЫгп. ВюрйуиАсса. 1987. К892. Р.191 — 196. 5. Кищейо~ А. К,Тй~е! Т., ес а1. Бсг1Ып8 ййегепсеь Ьеомееп сне Ыпес!сз оГ геую!асюп оГ гевр1гас!оп Ьу АВР 1и ь1ов-съчссЬ апд Гай-ск1ссЬ гпщс1ея 1и нчо// ЕпгЗ.Вюсйеш 1996, У.241.
Р.909 — 915. Задача 8. Кардиотропные эффекты природных гипометаболических факторов ВВЕДЕНИЕ Экспериментальное изучение понижения метаболизма имеет значение как для фундаментальной физиологии, так и для практической медицины. В природе проблема регулируемого обратимого снижения метаболизма успешно решается в организме гибернирующих и холодоадаптированных животных (суслики, сур- 192 Часть 11. Практические задачи по патофизиологии ки, медведи и др.), у которых в период зимней спячки интенсивность всех основных биологических процессов снижается в десятки раз (Хочачка, Сомеро, 1988). Уникальными особенностями обладает и сердечно-сосудистая система зимоспящих животных: при падении температуры тела до 1 — 4 С сердце противостоит фибрилляции, сохраняет способность к сокращению и устойчиво к аритмиям и т.п; Одним из направлений поиска триггера спячки является последовательное тестирование биологической активности фракций из тканей гибернирующих и холодоадаптированных животных.
Из мозга и кишечника якутского суслика и холодоадаптированной якутской лошади в лаборатории химии пептидов ИБХ РАН им. Шемякина и Овчинникова были выделены низкомолекулярные пептидные фракции и отдельные вещества, обладающие невидоспецифичными кардиотропными эффектами.
Данные фракции не только обладают кардиотропными свойствами, но имеют выраженные антиметаболические и гипотермические свойства. В последние годы из мозга бурого медведя и якутского лося были выделены уксуснокислые экстракты, которые также обладали биологической активностью. Кардиотропное действие суммарных фракций из тканей гибернирующих и холодоадаптированных животных не имеет видовой специфичности, поэтому ингибиторные эффекты на сердца теплокровных и холоднокровных животных были сопоставимы (Сухова и др., 1999). На сегодняшний день известно, что составляющими компонентами суммарной фракции тканей гибернантов являются вещества пептидной и нуклеотидной природы (Негуляев и др., 1995).
В настоящее время выделено и идентифицировано более 50 пептидов. Вещества нуклеотидной природы идентифицированы как АМФ, АТФ, АДФ, ГМФ и ГТФ. Среди пептидов, выделенных из тканей животных-гибернан ов, имеется группа пептидов — производных а-цепи гемогло ина (ТБКУК, ТВКО, 'Ш). Цель работы.
Проанализировать кардиотропное действие на сердце лягушки экстрактов тканей гибернирующих и холодоадаптированных животных, а так же их отдельных составляющих. МЕТОДИКА Работа проводится на препаратах изолированного сердца травяной лягушки в условиях круговой перфузии. Кардиотропные эффекты гипометаболических факторов оцениваются по механической активности сердца. Материалы и оборудование.
1. Препаровальный набор инструментов; препаровальная пластинка, зонд; 4 серфина; 2 канюли; установка для перфузии сердца. Тема 11. Патофизиология сердечно-сосудистой системы 2. Раствор Рингера для холоднокровных (ХаС1 — 111 мМ; КС1— 1,9 мМ; СаС1, — 1,7 мм; ХаНСО, — 2,4 мМ). 3. Установка для регистрации механограммы: механо-индукционные преобразователи, усилители, самописец или компьютер. 4. Экстракты из тканей гибернизирующих животных или отдельные пептиды, входящие в их состав (мол. масса 1 — 10 кД). Препаровка. С помощью зонда лягушку (предпочтительно брать самцов) обездвиживают разрушением центральной нервной системы.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
