И.П. Ашмарин, А.А. Каменский, Г.С. Сухова - Руководство к практическим занятия по физиологии человека и животных (1128356), страница 33
Текст из файла (страница 33)
Определить величину локального мозгового кровотока в сенсомоторной коре мозга крысы в норме и при гиперкапнии. МЕТОДИКА Материалы и оборудование. Измерительная установка с графопостроителем и осциллографом, газовый тракт для ингаляционного введения водорода в ткани крысы. Индикаторные электроды. В качестве индикаторных (рабочих) электродов используют платиновые микроэлектроды с диаметром кончика 3 — 10 мкм, изолированные по всей длине, кроме кончика, стеклом или лаком. Это электроды открытого типа, которые характеризуются непосредственным контактом рабочей поверхности микроэлектрода с исследуемым объектом. Свойства открытых микроэлектродов со временем ухудшаются.
Поэтому существуют два принципиально различных пути преодоления этого. Первый заключается в периодической чистке электрода (механической, химической„электрохимической), Другой путь заключается в двухэтапном — а) электрохимическом (покрытие платиновой чернью) и б) биологическом (помещение на несколько дней в физра- Часть 11. Практические задачи по патофизиологии створ с органическими добавками) — состаривании электродов. После переходных процессов пассивации, электрической и химической сорбции достигается стационарное состояние микроэлектродов со сниженной, но достаточно большой чувствительностью к измеряемому веществу, обеспечивающее хорошую воспроизводимость отклика при повторных калибровках в стандартных условиях. Изготовление платиновых лакированных микроэлектродов включает следующие стадии: 1) электросварка платиновой проволоки диаметром 0,1 мм с медной проволокой диаметром 0,4 мм; 2) электрохимическая заточка платиновой проволоки в ванне с 20%-м раствором КХО, с последующей промывкой в проточной воде; 3) покрытие винифлексным лаком и сушка (7 — 9 раз) в муфельной электропечи; 4) визуальный контроль под микроскопом; 5) механическая зачистка кончика микроэлектрода на нулевой наждачной бумаге и промывка в проточной воде; 6) покрытие кончика микроэлектрода платиновой чернью в ванне 3%-й платинохлористоводородной кислоты и 2%-го агар-агара с последующей промывкой в проточной воде; 7) контроль параметров микроэлектрода (остаточного тока, хемочувствительности) на установке для контроля параметров и на измерительной установке для полярографического анализа.
Вспомогательные электроды. Вспомогательный (референтный) электрод является опорным элементом, в сравнении с которым производится измерение. В полярографии поляризуется лишь индикаторный электрод. Референтный электрод обеспечивает непрерывность электрической цепи, почти не подвергаясь поляризации. Вспомогательные электроды должны обладать значительно большей поверхностью и малой плотностью тока по сравнению с индикаторными электродами. В качестве референтного электрода обычно используют серебряную проволоку (полоску) диаметром (шириной) 0,2 — 0,5 мм, покрытую хлоридом серебра.
При работе с наркотизированными животными используют инъекционную иглу (0,8 х40 мм) из нержавеющей стали, которую втыкают в хвост животного. Измерительная установка для полярографического анализа. Блоксхема измерительной установки приведена на рис. 9. В нее входят: источник стабилизированного напряжения, усилитель, графопостроитель, осциллограф. Источник стабилизированного напряжения обеспечивает рабочее напряжение +0,27 В.
Тема 11. Патофизиология сердечно-сосудистой системы Рис. у. Блок-схема измерительной установки для полярографического анализа Для измерения диффузионного тока последовательно с индикаторным микроэлектродом включают дополнительное сопротивление. Падение напряжения на Л,„, равное У, Я „, измеряют с помощью усилителя. Основные требования к усилителю: а) входное сопротивление >1 ГОм; б) коэффициент усиления по постоянному току 1 — 50; в) регулировка баланса нуля. С выхода усилителя сигнал, пропорциональный измеряемому диффузионному току, поступает на вход графопостроителя ПДА (Епйт), который осуществляет запись полярограммы на бумаге.
Осциллограф С1-69 выполняет контрольные функции, Газовый тракт. Газовый тракт состоит из воздушной магистрали, баллона с азотом, емкостей с водородом и 20%-м углекислым газом, двух трехходовых газовых переключателей и блока ротаметров для измерения расходов газов. В экспериментах используется ингаляционнный способ введения водорода в ткани животного, когда крыса в течение 1 мин дышит смесью из 1,5 л/мин воздуха и 0,5 л/мин водорода через резиновую маску. Нормобарическая гипоксия обеспечивается добавлением к потоку воздуха 0,5 л/мин азота в диапозоне 0,5 — 5,0 л/мин, а гиперкапния— добавлением к потоку воздуха 1 л/мин 20% углекислого газа в диапазоне 0,5 — 1,5 л/мин.
Препаровка и подготовка к работе. Наркотизированную крысу помещают в стереотаксис. С головы животного выщипывают (выстригают) шерсть в пределах осей "глаза — уши",обозначая операционное поле, которое обрабатывают спиртовым раствором йода. Для местной анестезии подкожно вводят 1 мл 2%-го новокаина. Ножницами, шпателем, электрокоагулятором (для устранения местных кровотечений) с операционного поля удаляют кожу и мягкие ткани, открывая череп, который тщательно очищают и высушивают с помощью эфира. Сверлом диаметром 0,9 мм, установленным в миниатюрную электродрель, делают отверстие в кости черепа над сенсомоторной корой вплоть до твердой мозговой оболочки (Жга гпаМг).
Микроэлектрод устанавливают в держателе головки стереотаксиса и с 172 Часть 11. Практические задачи по патофизиологии помощью его манипуляторов опускают через трепанационное отверстие в кости до дога та1ег и несколькими толчками погружают на глубину до 1 мм в сенсомоторную область коры. Контроль качества установки микроэлектрода осуществляют в результате регистрации электрической активности нейронов коры. При ее наличии микроэлектрод фиксируют на черепе с помощью зубных пластмасс (цементфосфата и акрилоксида). После полимеризации акрилоксида вывод микроэлектрода отрезают ножницами в 2 — 3 мм от купола пластмассы, животное снимают со стереотаксиса, укладывают на термостолик и мягко фиксируют на нем.
В анус устанавливают термистер для измерения ректальной температуры, которую поддерживают с помощью термостолика в пределах 37+0,5 С. На морду крысы надевают резиновую маску, в которую вставлены 2 штуцера. По одному штуцеру подается газовая смесь, через другой штуцер маска подключается к оксианализатору для контроля герметичности прижима маски к морде крысы. В хвост животного втыкают иглу референт- ного электрода. К выводу платинового микроэлектрода с помощью миниатюрного электропаяльника подпаивают тонкий медный провод диаметром 0,08 мм, который подсоединяет микро- электрод к измерительной установке.
ХОД РАБОТЫ 1. Определение локального мозгового кровотока в норме (фоновая запись). В маску крысы подается 1,5 л/мин воздуха. Открыть клапан емкости с водородом и подать в маску 0,5 л/мин водорода в течение 1 мин. На бумажном листе графопостроителя регистрируется полярографический отклик (рис. 10), имеющий фазу нарастания, пропорциональную росту концентрации водорода в месте расположения микроэлектрода, и фазу спада (клиренса), пропорциональную величине кровотока в этой области. Следующий замер кровотока делается через 10 — 15 мин, когда писчик графопостроителя вернется к нулевому значению (ткани животного полностью освободятся от введенного водорода).
Аналогично делаются б замеров фонового значения локального кровотока. 2. Определение локального мозгового кровотока при гиперкапнии 5% СО,, Выполнить пункт 1. Одновременно с закрытием клапана емкости с водородом открыть клапан емкости с угле- кислым газом. Подать в маску 0,5 л/мин 20 % СО, в течение времени, пока первоначальное значение клиренса (амплитуда отклика) не уменьшится в 2 раза.
3. Определение локального мозгового кровотока при гиперкапнии 7% СО~ Выполнить пункт 1. Одновременно с закрытием кла- Тема И. Патофизиология сердечно-сосудистой системы 1, нд л/минЛОО г 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112 131415 16 17 Время, с Рис. 10. Полярограмма локального мозгового кровотока в сенсомотор- ной коре мозга крысы пана емкости с водородом открыть клапан емкости с угле- кислым газом. Подать в маску 0,75 л/мин 20% СО, в течение времени, пока первоначальное значение клиренса не уменьшится в 2 раза.
4. Олределение локального мозгового кровотока ври гииеркаинии 9% СО,. Выполнить пункт 1. Одновременно с закрытием ю~апана емкости с водородом открыть клапан емкости с угле- кислым газом. Подать в маску 1,0 л/мин 20% СО, в течение времени, пока первоначальное значение клиренса не уменьшится в 2 раза. ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ По формуле (2) определяют величину локального кровотока на всех полученных полярограммах. Первые три записи фона не учитывают, так как при первых подачах водорода вследствие "жадного" поглощения (до 100 объемов) водорода платиной клиренс всегда круче, пока не установится равновесное состояние "водород — электрод".
По следующим трем замерам фонового кровотока определяют ~ и принимают его за 100%: у Х4+Х5+Хб 3 Определяют относительное изменение локального мозгового кровотока при гиперкапнии 5%, 7%, 9% СО, во вдыхаемой газовой смеси и делают выводы. Статистическую обработку данных проводят по методу Фишера-Стьюдента. Часть 11. Практические задачи по патофизиологии 174 Рекомендуемая литература 1. Виноградова Е.Н., Галлай З.А., Финогенова З.М Г1олярографические и амперометрические методы анализа. М., 1963. 2. Гейровский Я. Основы полярографии. М., 1965. 3. Демченко И.Т. Методы изучения мозгового кровообращения//Методы исследования кровообращения. Л,, 1976.
4. Коваленко Е А., Березовский В.А., Этитейн И.И. Полярографическое определение кислорода в организме. М., 1976. 5. Кондагиевская М.В., Сергеев В.И.„Ляиина Л.А., Смолина Т,Ю. Некоторые аспекты действия комплекса гепарин - серотонин на кровь и кровоток//Изв. РАН. Сер. Виол., 1998. М 1. С. 98 — 101. Задача 5. Геморрагический инсульт у крыс линии Крушинского-Молодкиной и его коррекция путем предварительной адаптации животных к дефициту кислорода ВВЕДЕНИЕ Значительная распространенность острых нарушений мозгового кровообращения геморрагического типа и высокая смертность при инсультах диктуют необходимость поиска новых средств профилактики и лечения этих заболеваний. Одна из наиболее адекватных моделей геморрагического инсульта — нарушения церебральной гемодинамики у крыс линии Крушинского-Молодкиной ~КМ), вызванные звуковым стрессом.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
