Лекции 2014-го года (1125726), страница 5
Текст из файла (страница 5)
Фокусировка лампы и центрировкаосветителя.2. Фокусировка полевой диафрагмы.3. Центрировка диафрагмы конденсора спомощью вспомогательного микроскопа.4. Окончательная настройка осветителя.5. Согласование полевой и апертурнойдиафрагм с используемым объективом.Необходимые элементы дляустановки света по КелеруВ микроскопе должны быть:• Регулируемая полевая диафрагма(осветителя)• Регулируемая и центрируемая апертурнаядиафрагма (конденсора)• Перемещающийся в трех плоскостяхконденсорЛекция 6.Методы усиления контраста вмикроскопии: темное поле,фазовый контраст,интерференционный контрастПоследовательные шаги:1) Полностью открыть полевую иапертурную диафрагмы, увидетьпрепарат2) Сфокусироваться на препарат•Закрыть полевую диафрагму•Сфокусировать изображениедиафрагмы перемещая конденсорвверх-вниз•Центрировать полевую диафрагму,затем открыть ее до освещенияполя зрения•Вставить вспомогательныймикроскоп•Закрыть апертурную диафрагму до4/5 апертуры объектива1) Открыть полевую и апертурнуюдиафрагмы2) Сфокусировать препарат3) Закрыть полевую диафрагму•Сфокусировать изображениедиафрагмы перемещаяконденсор вверх-вниз•Центрировать полевуюдиафрагму, затем открыть ее доосвещения поля зрения•Вставить вспомогательныймикроскоп•Закрыть апертурную диафрагмудо 4/5 апертуры объектива1) Открыть полевую и апертурнуюдиафрагмы2) Сфокусировать препарат3) Закрыть полевую диафрагму4) Сфокусировать изображениедиафрагмы, перемещая конденсорвверх-вниз•Центрировать полевуюдиафрагму, затем открыть ее доосвещения поля зрения•Вставить вспомогательныймикроскоп•Закрыть апертурную диафрагмудо 4/5 апертуры объектива1) Открыть полевую и апертурнуюдиафрагмы2) Сфокусировать препарат3)Закрыть полевую диафрагму4) Сфокусировать изображениедиафрагмы перемещая конденсорвверх-вниз5) Центрировать полевую диафрагму•затем открыть ее до освещенияполя зрения•Вставить вспомогательныймикроскоп•Закрыть апертурную диафрагму до4/5 апертуры объектива1) Открыть полевую и апертурнуюдиафрагмы2) Сфокусировать препарат3)Закрыть полевую диафрагму4) Сфокусировать изображениедиафрагмы перемещая конденсорвверх-вниз5) Центрировать полевую диафрагму6) Открыть ее до освещения поля зрения•Вставить вспомогательный микроскоп•Закрыть апертурную диафрагму до 4/5апертуры объектива1) Открыть полевую и апертурную диафрагмы2) Сфокусировать препарат3) Закрыть полевую диафрагму4) Сфокусировать изображение диафрагмыперемещая конденсор вверх-вниз5)Центрировать полевую диафрагму6)Открыть ее до освещения поля зрения7)Вставить вспомогательный микроскоп8)Закрыть апертурную диафрагму до 4/5апертуры объективаПримечание: для малоконтрастногопрепарата закройте диафрагмуконденсора до ~ 30% NAобъективаЗФП1)2)Открыть полевую и апертурную диафрагмыСфокусировать препарат3)Закрыть полевую диафрагму4) Сфокусировать изображение диафрагмыперемещая конденсор вверх-вниз5) Центрировать полевую диафрагму6) Открыть ее до освещения поля зрения7) Вставить вспомогательный микроскоп8) Закрыть апертурную диафрагму до 4/5 апертурыобъектива9) Вынуть вспомогательный микроскоп и вставитьокулярГотово!Преимущества установкисвета по Келеру1.
Гомогенное освещение поля зрения.2. Численная апертура конденсора и величинаосвещенного поля на столике микроскопа могутрегулироваться независимо друг от друга.3. Плоскость переднего фокуса конденсорапередается в заднюю фокальную плоскостьобъектива. Это создает минимум рассеянногосвета в оптическом пути микроскопа иоптимальные условия для усиления контрастаизображения.4. Достигается максимальное латеральное (x-y) иосевое (z) разрешение микроскопа.Основные ошибки приустановке света1.
После установки света конденсор опускался.2. При смене объектива не перестраивалисьполевая и апертурная диафрагмы.3. В ход лучей вместо нейтральных светофильтровввели матовое стекло.4. Изображение диафрагмы конденсора имеетнеравномерную кайму.Все отклонения в настройке света приводятк снижению контраста изображения!Методы усиленияконтраста в проходящемсвете – визуализациянеокрашенных препаратовМетод темного поляПринцип метода – в объектив попадаеттолько свет, преломленный илирассеянный объектом (Зидентопф, 1907,1909).Для получения яркого и контрастногоизображения используется объектив срегулируемой апертурой и специальныйвысокоапертурный конденсор.Ограничение метода: часто видны тольконаружные границы объекта, а внутренняяструктура может не разрешаться.Освещение в темном полеМалое увеличение – сухой конденсор сцентральным экраном и диафрагмойБольшое увеличение (иммерсия) –иммерсионный кардиоидный конденсор спостоянной апертурой, иммерсионныйобъектив с апертурной диафрагмойДля живых объектов максимальнаяапертура конденсора – 1, 336.Кардиоидный конденсорКардиоидный конденсор создает полый конус света, внутренийугол которого немного превышает апертуру объектива.Ход лучей в темном полеТемнопольные изображенияА-С – хламидомонады; D – буккальный эпителийА – светлое поле, конденсор опущен; B – светлое поле,освещение по Келеру; С, D – темное полеБактерия в темном полеБактерия среди эритроцитов.
Видны только границы клеток.Диатомовые водоросли втемном полеРазрешающая способностьмикроскопа в темном полеОпределяется яркостью источника света иточностью настройки хода лучей.Минимальный диаметр частиц – 40 нм;толщина нитчатых структур – 15-20 нм(бактериальные жгутики, отдельныемикротрубочки).Фазовый контрастПринцип метода:Падающий свет проходит через кольцевую диафрагмуконденсора и его интенсивность ослабляется кольцевойпластинкой, напыленной в объективе.Изображение формируется как результат интерференция двухволновых фронтов: прямого света и света, преломленногообъектом.Для эффективной интерференции преломленный светдополнительно замедляется на ¼ длины волны.Опыты ЦерникеОпыт 1.
Мелкие частицы угля дают при освещении по Келерутемное изображение – диск Эри.Опыт 2. Если при коноскопическом освещении закрытьдиафрагму конденсора и в з.ф.п. объектива расположитьмаленький экран, закрывающий диск Эри, то изображение частицыокажется светлым диском Эри на темном фоне.Опыт 3. Если в тех же условиях заменить маленькую маску вз.ф.п. объектива на большую, но с отверстием, соответствующимдиску Эри в центре, то изображение частицы полностью исчезает.Опыт 4. Берется прозрачный образец, который не даетизображения при настройке света по Келеру и точнойфокусировке.
Однако он дает видимое, но малоконтрастноеизображение при дефокусировке.Опыт 5. Аналогично опыту 2 в з.ф.п. объектива располагаетсямаленький непрозрачный экран. Тогда объект становится виденкак светлый диск Эри.Таким образом, прозрачный и непрозрачный объекты преломляюти рассеивают свет.Опыт 2. Если закрытьдиафрагму конденсора и вз.ф.п. объектива расположитьмаленький экран, закрывающийдиск Эри, то изображениечастицы окажется светлымдиском на темном фоне.Опыт 3. Если заменитьмаленькую маску в з.ф.п.объектива на большую, но сотверстием, котороесоответствует диску Эри вцентре, то изображение частицыполностью исчезаетОпыт 4. Беретсяпрозрачный образец, которыйне дает изображения принастройке света по Келеру иточной фокусировке.
Однакоон дает слабое изображениепри дефокусировке.Опыт 5. Аналогично опыту2 в з.ф.п. объектива ставитсямаленький непрозрачныйэкран. Тогда объектстановится виден в плоскостиизображения как светлыйдиск Эри.Поглощающие и фазовые объектыПоглощающий объект – виден в проходящемсвете за счет поглощения прямого света.Изменения волнового фронта, создаваемыеобъектом, несущественны для наблюдения.Фазовый объект – плохо виден в проходящемсвете (малое поглощение), однако модифицируетволновой фронт за счет преломления иотражения части света.Темное поле – выделение света, преломленногои рассеянного объектом (модифицированноговолнового фронта).Фазовый контраст – суперпозиция светлого итемного поля.Выводы ЦерникеСвет, преломленный поглощающим объектом, отстает наполовину длины волны, и поэтому эффективно интерферируетв з.ф.п.
объектива с непреломленным светом.Свет, преломленный непоглощающим (фазовым) объектом,отстает на четверть длины волны, и их интерференциянеэффективна.Для того, чтобы интерференция прошедшего и преломленногосвета давала различия в яркости, их сдвиг должен составлятьоколо половины длины волны, а интенсивность бытьпримерно одинаковой.Для достижения этих целей используется специальная«фазовая» пластинка для объектива и кольцевая диафрагмаконденсора.В микроскопе наиболее эффективной оказывается пластинка свытравленной в ней кольцевой канавкой для прямого света.Устройство фазового контрастаСветовой фронт, преломленный объектом, дополнительносдвигается (отстает) от проходящего фронта на четвертьдлины волны.Свет, прошедший через объект, ослабляется в такой степени,чтобы его интенсивность примерно соответствовалаинтенсивности преломленного света (в 4 раза и более).Освещение препарата производится через кольцевуюдиафрагму конденсора, которая оптически согласована скольцевой пластинкой объектива.Максимальная эффективность наблюдения (максимальныйконтраст) достигается при использовании зеленого света (546нм).Ход лучей впозитивномфазовомконтрастеФормирование изображенияв фазовом контрастеФазовоконтрастный микроскопСтроение фазового кольцаобъективаКомплект для фазового контрастаРевольвер конденсораФазовый телескоп и объективУстановка света в фазовомконтрасте1.
Установите полупрозрачный и достаточно тонкий препарат на столикмикроскопа и конденсор в режим светлого поля. Для наведения нафокус вам может понадобиться закрыть апертурную диафрагмуконденсора.2. Установите в микроскопе свет по Келеру. Изображение станетпрактически невидимым.3. Выньте окуляр, и установите вместо него вспомогательныймикроскоп. Сфокусируйте вспомогательный микроскоп на заднююфокальную плоскость объектива.
На светлом поле будет резко виднасерая кольцевая пластинка – фазовое кольцо объектива.4. Полностью откройте апертурную диафрагму конденсора. Установитев ход лучей в конденсоре кольцевую (фазовую) диафрагму,соответствующую выбранному объективу. Диафрагма конденсорабудет иметь вид яркого светлого кольца.5. Юстировочными винтами фазового кольца конденсора совместитедва изображения. Светлое кольцо (конденсора) должно расположитьсяполностью внутри темного кольца (объектива).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
