Лекции 2014-го года (1125726), страница 11
Текст из файла (страница 11)
Неоднородное освещение поля зрения.2. Пылинки и грязь, находящиеся в оптическом путимикроскопа.3. Интерференционные картины (муаровый рисунок) вплоскости изображения.4. Низкий контраст важных деталей изображения.5. Сдвиг цветового баланса (для цветных изображений).Для устранения всех этих недостатков применяется цифроваяобработка изображения.Отношение сигнал/шум в процессе обработки всегда снижается,и его нельзя увеличить, поэтому обработка изображений снизким отношением сигнал/шум практически затруднена.Задачи цифровой обработкиизображения1. Удаление отдельных дефектов изображения.2. Избирательное контрастирование деталей(уменьшение контраста фона).3.
Растяжение гистограммы яркости и/илинелинейное преобразование гистограммыяркости.4. Приближение записанного изображения квизуально воспринимаемому.5. Арифметические операции с кадрами.6. Сегментация изображения для морфометрии.Преобразования изображенияКоррекция фона (коррекция на плоское поле зрения иливычитание).Изменения интенсивности –линейные (растяжениегистограммы) и нелинейные (гамма-коррекция), инверсия.Конволюция (пространственная свертка) с масками (kernels)Деконволюция (обратная свертка).Преобразование Фурье и фильтрация в пространстве ФурьеНаложение нерезкой маски.Геометрические преобразования (интерполяция, поворот,устранение дисторсии и проч.).Бинаризация (односторонняя, двухсторонняя).Сжатие без потери информации.Сжатие в формат JPEG (с потерей информации).Обработка изображения с помощьюматриц – конволюция (свертка)Элементом преобразования является ядро или маска (kernel),размер которой составляет несколько пикселов (обычно –квадраты 3х3; 5х5; 7х7 и т.п.)Маска содержит коэффициенты, сумма которых равна единице.Центр маски последовательно накладывается на все пикселыизображения, и их значения пересчитываются в пикселы новогоизображения.Края изображения при этом деформируются, так как маска неможет быть правильно применена к пикселам, отстоящим открая на расстояние меньше, чем ее радиус.В зависимости от коэффициентов различают много видов масок– низкочастотные (low pass), высокочастотные (high pass),контрастирующие, асимметричные и проч.Примеры простейших масок(kernels)Low pass(сглаживание)High pass(контрастирование)Edge enhancement(контрастированиекрая)Сглаживание шумов(размытие)Фильтр Гаусса, 5x5 (делитель – 99)Результаты фильтрацииДля сохранения информации диаметр маски (kernel)должен быть меньше разрешающей способностимикроскопа.
При использовании больших поплощади масок, повышающих контраст, происходитизбирательное контрастирование одних деталей исмазывание или удаление других элементовизображения.Для конволюции без потери разрешенияэквивалентный размер пиксела должен быть покрайней мере в 2 раза меньше, чем предел,задаваемый телеграфной теоремой.ImageJ для микроскопииImageJ, это свободно распространяемая (Public domain), написанная наязыке Java программа для анализа и обработки изображений,разработанная в Национальном Институте Здоровья в США.ImageJ была создана с открытой архитектурой, которая обеспечиваетрасширяемость при помощи плагинов Java, а также макросов,создаваемых пользователями.ImageJ позволяет отображать, редактировать, анализировать,обрабатывать и сохранять 8-битные, 16-битные и 32-битные ч/бизображения, а также 24-битные цветные изображения.
Программаможет читать многие форматы изображений, такие как TIFF, BMP, PNG,GIF и др., а также многие RAW форматы.Пользовательские модули получения, анализа и обработки могут бытьнаписаны с помощью встроенного редактора ImageJ и Javaкомпилятора.Плагины, написанные пользователями, позволяют решать многие задачианализа и обработки изображений, позволяют проводить трехмернуювизуализацию, морфометрический анализ, а также создаватьавтоматизированные микроскопические системы.Лекция 12КонфокальныймикроскопПринципы и основные моделиКонфокальный микроскоп МинскогоСканирующийконфокальный микроскопИзображение формируется поточечно за счетпоследовательного сканирования препаратасфокусированным лазерным пучком.Сигнал от препарата детектируется ФЭУ,расположенным позади конфокальной диафрагмы.Изображение записывается в компьютер с помощьюАЦП и выводится на экран с помощью ЦАП.Генерация происходит также, как в телевизоре илисканирующем электронном микроскопе.Разрешающая способность определяется диаметромпучка и шагом сканирования.Конфокальный эффектИнтенсивность света от расположенных вне фокуса областейпрепарата быстро снижается, и они дают незначительныйвклад в формирование изображения – получается почтиидеальный оптический срез.Для достижения конфокального эффекта большая частьсвета, падающего на детектор, отсекается диафрагмой,поэтому яркость изображения снижается.Наилучший эффект должен достигаться при сканированиипрепарата относительно неподвижного пучка, нопрактически это крайне неудобно, и сканированиепроизводится качающимся лучом или с помощью дискаНипкова.Лазерный сканирующий конфокальныймикроскоп (схема)Блок развертки(качающиеся зеркала)xyВыходящийлучВходящийлучРазвертка луча (сканирование)Качающиеся зеркала обеспечивают поточечное сканированиепрепарата лазерным лучом, сфокусированным через объективмикроскопа.MRC-1024 сканирующая головаКолесосо светофильтрами32Луч света от лазераФЭУ1Конфокальные диафрагмыКачающиеся зеркалаК объективу и от объективаКонфокальный блокустаревшего микроскопаСистема включает несколько лазеров и детекторов, переключениеосуществляется с помощью колес со светофильтрами.Физические ограничения вконфокальной микроскопииОтисточникаn1 photonsПИКСЕЛ – X,Yλ1α1δxδyδzВОКСЕЛ – X,Y,Zx,y,zα2Минимальныйразмер вокселаограничендифракционнымпределом (δx, δy, δz)λ2n2 photonsК детекторуFrom: Handbook of Biological ConfocalMicroscopy.
J.B.Pawley, Plenum Press, 1989Интенсивность света в перетяжкеПеретяжка вконфокальнойобычной имикроскопииЗависимость конфокальногоэффекта от иаметра диафрагмыстандартнаянастройкаРазмер диафрагмы детектора измеряется в диаметрахпервого минимума диска Эри (AU – Airy units), то естьзависит от апертуры объектива.Перетяжка в конфокальноймикроскопииАBCDA – широкое поле, В – 4,3 диска; С – 2,5 диска; D – 0,7 диска ЭриВарианты конфокальныхсистем1. Лазерный сканирующий микроскоп (переменныедиафрагмы, изображение только электронное)2.
Тандемный микроскоп с диском Нипкова(постоянные диафрагмы, изображение реальное)3. Лазерный сканирующий микроскоп сосканированием в линии (одна диафрагмапостоянная, конфокальный микроскоп реальноговремени)Диск НипковаОтверстия в диске расположены по спирали и на равном угловомрасстоянии (α) друг от друга. На диске может быть несколькопараллельных спиралей.Конфокальные системыКонфокальные системыСканируюшаяС диском НипковаДетекторыВ лазерном сканирующем микроскопе –фотоэлектронный умножитель (ФЭУ).ФЭУ позволяет регулировать усиление, но имеетквантовый выход не более 20% в районе 500 нми низкий квантовый выход для красного света(>600 нм).В микроскопе с диском Нипкова – охлаждаемаяПЗС камера.Имеет высокий квантовый выход (60-90%) вшироком диапазоне (500-800 нм), ноотносительно низкий квантовый выход (около30%) в синем свете (450 нм).Сравнение конфокальныхсистем• Лазерная сканирующая микроскопия – регулируемыйконфокальный эффект, но низкая чувствительность;увеличение может изменяться за счет шагасканирования без смены объектива; простоеуправление обесцвечиванием (FRAP, FLIP).
Времяполучения изображения составляет секунды-десяткисекунд.• С диском Нипкова – фиксированный конфокальныйэффект; изображение в реальном времени; большаячувствительность в желто-красной области.Широкопольная и конфокальнаямикроскопия (толстые препараты)Широкопольная и конфокальнаямикроскопия (тонкий препарат)Микротрубочки в живой клетке. Слева - обычная флюоресцентнаямикроскопия; справа - конфокальная система с диском Нипкова.Параметры, определяющиекачество изображения1. Отношение сигнал/шум.2. Настройки микроскопа (юстировка лазерногопучка, установка конфокальной диафрагмы,установка мощности лазера).3.
Скорость сканирования (время экспозиции точкипри растровой микроскопии).4. Точность работы сканнера.5. Фотообесцвечивание.6. Затекание сигнала из соседних каналов.7. Автофлуоресценция препарата.8. Сферическая аберрация для толстых препаратов.Оценка скорости сканированияМаксимальное количество фотонов от одной молекулы Fmax :Fmax = S · Qe · Iнас · Δ t [фотонов],гдеS – площадь эффективного сечения молекулы;Qe – квантовый выход при данной длине волны возбуждающегосвета;Iнас – максимальная интенсивность потока возбуждающего светаΔ t – время освещения одного воксела (~10-6 c)Количество собранного света уменьшается пропорциональноквадрату апертуры объектива и степени закрытия диафрагмыперед детектором.При сканировании с максимально закрытыми диафрагмамимощность лазера должна быть близка к насыщающей, и времязаписи одного воксела должно быть достаточно велико.Лазеры для конфокальноймикроскопииГазовые лазеры – аргоновый (488, 514,5 нм и др.),гелий неоновые (541, 633 нм).Недостаток – ограниченное время жизни (5000 часови менее) маломощных лазеров.Диодные лазеры – индивидуальные длины волн.Время жизни зависит от мощности.
Оптимальнаямощность составляет более 50 мВт.Для ограничения мощности лазерного пучкаприменяется либо управление мощностью спомощью регулируемых акусто-оптическихзатворов, либо светофильтры..
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
