Лекции 2014-го года (1125726), страница 6
Текст из файла (страница 6)
Если видимая ширинасветлого кольца равна или больше, чем ширина темного, то первуюможно несколько уменьшить, перемещая конденсор вверх или вниз.Центрировка фазового кольцаПри правильной установке светлое кольцо должнополностью находиться внутри темного кольца. Чембольше ширина темных ободков, тем выше контраст.Центрировка фазового кольцаКайма вокруг краевРеализация методафазового контрастаСдвиг волновых фронтов преобразуется в результатеих интерференции в з.ф.п. объектива в разностьамплитуд.Ограничения:1. Эффективный контраст возникает только тогда,когда величина сдвига одного фронтаотносительно другого незначительно отличаетсяот половины длины волны.2.
Темные и светлые объекты окружены каймой спротивоположной яркостью. Ширина каймызависит от разности оптического хода двухфронтов.Типы фазового контрастаПозитивный фазовый контраст + ¼ длины волны(травление). Объекты, замедляющие свет, выглядяттемнее фона.Негативный фазовый контраст - ¼ длины волны(напыление). Объекты, замедляющие свет,выглядят светлее фона.Аноптральный или фазово-темнопольный контраст– большой диаметр запирающего кольца, малоесветопропускание.Позитивный и негативныйфазовый контрастОбъективы для фазовогоконтрастаМаркировка – Ph + цифра (номер кольца).Типы: планахроматы, флюоритовые,планапохроматы.Недостаток – немного сниженноесветопропускание (~на 5-10%).Максимальный контраст достигается прииспользовании зеленого светофильтра.Интерференционный контрастПринцип метода:Падающий свет делится на два волновых фронта.
Изображениеформируется как результат интерференция двух волновыхфронтов, прошедших через разные области поля зрения.Существует две основных системы – микроскоп ЖаминаЛебедева и система Номарского.В первом случае происходит интерференция двух фронтов,разделенных большим расстоянием (десятки микрон), то естьсравнивается свет прошедший через объект и мимо объекта.В системе Нормаского сдвиг фронтов минимален, и фактическивыявляется градиент изменения показателя преломления внутриобъекта.Разность оптического ходаХод лучей придифференциальноминтерференционном контрастеПоляризатор и анализатор повернуты под углом 45о к плоскостиразделения лучей призмами Волластона и под углом 90о друг кдругу. Это обеспечивает равную интенсивность двух волновыхфронтов и позволяет свести к минимуму прямой свет.Дифференциальныйинтерференционный контрастСдвиг волнового фронта преобразуется в разностьамплитуд в результате интерференции двух почтисовпадающих фронтов, создаваемых за счетдвулучепреломляющей системы.Прямой проходящий свет подавляется с помощьюскрещенных поляризатора и анализатора.Направление и величина сдвига одного фронтаотносительно другого регулируются настройкамимикроскопа.Фактически DIC контраст отражает градиентизменения оптической плотности внутри препарата.Интерференционный контрастКомплектующие к DICКадры с различным сдвигомКомбинированное изображение –флюоресценция и DICФазовый контраст и DIC(Nomarski)Сине-зеленая водоросль (цианобактерия)Разные виды контрастаСравнение методов фазового иинтерференционного контрастаСравнение фазовогоконтраста и DICУстановка света – проще в ФК.Возможности усиления контраста – больше вDIC.Светопропускание объективов – больше вDIC.Величина ореола (сдвига) – настраиваемая(или постоянная) в DIC и зависит от объектав ФК.Непрерывный контур – есть в ФК и нет в DIC.Сравнение различных методовЗависимость CTF от размеров в системах с усилениемконтраста нелинейная, в отличие от светлого поля.Лекция 7Явление флуоресценции.Устройство флуоресцентногомикроскопа.Источники света дляфлуоресцентной микроскопииПравило СтоксаСэр Дж.
Стокс, 1-й баронет. Описал правило Стокса в1852 г.Спектр испускания и спектр поглощения несовпадают, причем, как правило, максимумпоглощения приходится на меньшую длину волны,чем максимум испускания.Сдвиг между максимумами поглощения и эмиссии –сдвиг Стокса.Спектры поглощения и испускания флюорохроманезависимы. Эмиссия ненаправлена.Правило СтоксаДиаграмма ЯблонскогоЯвление флуоресценцииВремя поглощения кванта света молекулой составляет около10-15 секунды. Диапазон энергий поглощаемых квантовопределяется структурой электронных оболочек в молекуле.Энергия поглощенного кванта света распределяется в молекуле(возбуждение), а затем новый квант света высвечивается(флуоресценция) или молекула возвращается на исходныйэнергетический уровень иным путем (релаксация).
Вальтернативе возбужденная молекула может претерпетьхимическую модификацию (переход в триплетное состояние).Запаздывание высвечивания составляет порядка 10-9 секунды.Эмиссия происходит равновероятно по всем направлениям.Сдвиг средней энергии высвечиваемого кванта обусловленпотерей энергии за счет внутренних колебаний на разрешенныхэлектронных уровнях поглощающей молекулы.Наиболее яркие органические флуорохромы – вещества счередующимися двойными связями.Примеры спектровнекоторых красителейСдвиг Стокса, как правило, невелик (10-30 нм).Спектры асимметричны, их «хвосты» заходят более, чемна 100 нм.
Спектры испускания имеют «красный» хвост,спектры возбуждения – «синий» хвост.Принцип флюоресцентноймикроскопииСдвиг Стокса используется для эффективноговыделения полос возбуждающего света и светаэмиссии из общего спектра.Интенсивность эмиссии составляет не более 10-4от интенсивности возбуждающего света, а частозначительно меньше.Для эффективного наблюдения флюоресценциинеобходимо подавить возбуждающий свет,попадающий в окуляр, с коэффициентом не менее,чем 108, желательно - 1010Для разделения возбуждающего света и светафлуоресценции используется системасветофильтров.Разделение возбуждающегосвета и света флуоресценцииЭпиосвещение – объектив одновременно служитконденсором.
Это позволяет свести к минимуму эффектпроходящего света.Куб светофильтров позволяет подавить нежелательныйсвет (отраженный препаратом и рассеянный) сэффективностью более, чем 107 за счет последовательногоприменения двух фильтров – светоделительного зеркала изапирающего светофильтра.Коэффициент запирания светоделительного зеркала – неболее, чем 102, у запирающего светофильтра – не менее 105(хорошие фильтры имеют коэффициент 106 и более)Общий вид флуоресцентногомикроскопаЭпифлуоресцентныймикроскоп, схемаКуб светофильтров - схемаПримечание Куб светофильтров изображен в своемположении на инвертированном микроскопе.
Лампаи окуляр находятся за пределами схемы.Типы светофильтровПо характеру пропускания – LP (long pass), BP (band pass), SP(short pass).По расположению – под углом 90о и под углом 45о (дихроичноезеркало).По конструкции – окрашенное стекло, интерференционныефильтры (изготовленные методом тонкослойного напыления).По применению: возбуждающие светофильтры,светоделительные зеркала, запирающие светофильтры.Дихроичный светофильтрМногослойное (10-200 слоев) тонкопленочное напылениедиэлектриками с чередующимися высокими и низкимипоказателями преломления обеспечивает эффективнуюинтерференцию большей части светового потока, и создает врезультате высокую избирательность пропускания – от 0,01 %до 0,00001% за пределами выбранного диапазона.Интерференционный(дихроичный) светофильтрМногослойное (10-200 слоев) тонкопленочное напылениедиэлектриками с чередующимися высокими и низкимипоказателями преломления обеспечивает высокуюизбирательность пропускания – до 0,00001 % в диапазонешириной до 500 нм.Примеры наносимых соединений (мягкое покрытие):показатель преломления 2.2-2.3: PbCl2, TiO2, ZnSпоказатель преломления 1.3-1.4: MgF2, SiO2, Na3AlF6.Толщина каждого слоя тщательно выдерживается, слоинаносятся методом вакуумного напыления.
Точные значениятолщин слоёв определяют положение кривую пропускания.От числа слоёв зависит ширина зоны пропускания фильтра,степень подавления и ширина ненужной части спектра.Интерференционныйсветофильтр с твердымпокрытиемТ.н. твердое покрытие - напыление слоев настеклянную подложку осуществляется с помощьюионной пушки.Твердость покрытия соответствует твердости стекла.Оно не выгорает и не «стареет» во влажных условиях.«Твердые» интерференционные светофильтры внастоящее время выпускают Semrock, Chroma,OmegaFilters.Особенности дихроичныхсветофильтровХарактеристики светофильтра сильно зависят от его угла поотношению к пучку света.Стандартная характеристика BP светофильтра – серединаполосы пропускания и ширина на полувысоте пропускания(FWHM).Например, обозначение ВР530/30 означает, что серединаполосы пропускания приходится на 530 нм, а 50% пропусканиеначинается с 530-30/2 = 515 нм и заканчивается на 530+30/2 = 545нм.Полный спектр пропускания, как правило, приводится впаспорте светофильтра.Светопропускание измеряется в % либо в единицах оптическойплотности (OD) – логарифмическая шкала.
Например, OD=5означает подавление света в 105 раз.Зависимость спектра от угланаклона фильтраСпектр пропусканиясветофильтраСпектр пропускания светофильтра анализируется в двухшкалах: линейной (0-100%, слева) и логарифмической (1-10-7,справа).Линейная шкала дает общую оценку пригодности светофильтра(по ширине на высоте полупропускания), логарифмическаяшкала позволяет оценить степень подавления нежелательноговозбуждающего света.Инвертированныйфлуоресцентный микроскопПолный ход лучейи сопряженныеплоскости вфлуоресцентноммикроскопеЭпиосветительКуб светофильтров примерыВозбуждающие светофильтр расположены слева,запирающий светофильтр – сверху.В правом кубе светофильтры вынуты. Дихроичноезеркало устанавливается по диагонали куба.Куб светофильтров светопропусканиеСпектры пропусканиясветофильтров в кубе – long-passСпектр пропусканиясветофильтров в кубе – band-passОсновные источники света дляфлюресцентной микроскопииРтутная лампа сверхвысокого давления (мощность100 Вт) – срок службы 300 часов.Ксеноновая лампа и смешанная (ртутно-ксеноновая)лампа (мощность 75-200 Вт) – срок службы 100-300часов.Металл-галидные лампы (мощность около 100 Вт) –срок службы 1000-2000 часов.Светодиоды («монохроматический» свет) – срокслужбы не менее 20000 часовЛазеры: газовые (мощность в линии – 1-1000 мВт);твердотельные с диодной накачкой (мощность 10300 мВт) – срок службы 5000-10000 часов.Дуговая ртутная лампасверхвысокого давленияИсточник света – пары ртути в дуговом разряде.Колба – плавленный кварц.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
