Лекции 2014-го года (1125726), страница 8
Текст из файла (страница 8)
Полученомножество мутантов.Исходный белок – 238 а-к,мол. вес 26,9 кД.Флуорофор находится вцентре складчатой структуры.Флюоресцентные белкикоралловMatz et al., 1999Характеристики некоторыхфлюоресцентных белковСпектры некоторыхфлуоресцентных белков(Evrogen)Лекция 9Флуоресцентнаямикроскопия.Цифровая камера ицифровая микроскопияПодбор светофильтров длякрасителяОпределение спектра возбуждения и испускания красителя –максимумы, ширина, асимметрия.Максимальная яркость – детектирование отдельных молекули другие случаи слабых сигналов. Используется широкаяполоса пропускания запирающего фильтра и LP запирающийфильтр. Такой подход неудобен для одновременногоиспользование нескольких красителей. Также он приводит котносительному возрастанию автофлуоресценции.Для максимальной селективности (при достаточной яркостисигнала) используется узкая полоса пропусканиявозбуждающего и запирающего фильтров, которыемаксимально соответствуют пикам поглощения и эмиссиикрасителя.
Это позволяет уменьшить автофлуоресценцию(которая всегда имеет широкий спектр) и добиться большейселективности при работе с несколькими флуорохромами.Способы флуоресцентногомеченияИммунофлюоресценция – прямая и непрямаяокраска конъюгироваными антителами.Флюоресцентная гибридизация нуклеиновыхкислот in situ (FISH) – конъюгированные зонды.Прямое связывание с мишенью (красители длянуклеиновых кислот – акридиновый оранжевый,DAPI).Красители, накапливающиеся в органеллах(жирные катионы в митохондриях - Rhodamin-123).Введение флюоресцентных белков – трансфекция(eGFP, DsRed).Флуоресцентные красителидля визуальных наблюденийФлуоресценция в диапазоне 450-630 нм.Возбуждение – УФ, синий свет (450-490 нм),зеленый свет (500-550 нм).Малое время высвечивания флуоресценции(большая яркость).Флюоресцентные красителидля инструментальныхнаблюденийФлюоресценция в диапазоне 400-850 нм.Возбуждение – УФ (340-395 нм), фиолетовый свет(407 нм); синий свет (450-490 нм), зеленый свет(500-550 нм), желто-красный свет (570-640 нм),ближний ИК свет (730-780 нм).Высокая фотостабильность, большой квантовыйвыход.Автофлуоресценция живыхклетокАвтофлуоресценция аминокислот – тирозин, триптофан,фенилаланин.
Белки – коллаген, эластин.Автофлуоресценция возбуждается в диапазоне 270-490 нм. Онапрактически отсутствует при возбуждении светом >500 нм.Эмиссия – синий свет (слабая), зеленый свет (средняя-сильная),желто-оранжевый свет (сильная).Автофлуоресценция клеток – в видимой области светят НАД-Н,рибофлавин, ретинол, липофусцин, меланин. Основныеорганеллы – предположительно лизосомы (не митохондрии!).Относительно яркой автофлуоресценцией обладаютмакрофаги, нейроны, мышцы, сперматозоиды.Автофлуоресценцияфиксированных клетокАвтофлуоресценция клеток может возрастать прификсации (особенно сильно – при альдегидной).Для ее уменьшения можно использоватьборогидрид натрия (свежеприготовленныйраствор в ФФБ), или избегать альдегидов всоставе фиксатора (метанол, ацетон при низкойтемпературе и др.).Чтобы уменьшить влияние автофлуоресценции,целесообразно пользоваться длинноволновымикрасителями (эмиссия свыше 580 нм).АвтофлюоресценциямиокардиоцитовАвтофлуоресценция доказывается широким спектромсвечения и отсутствием специфических окрашенныхструктур.Флуоресценция иавтофлуоресценция в клеткахрастенийЗеленый цвет – GFP-актин (трансфекция); красный –автофлуоресценция хлоропластовПрижизненные наблюденияПоддержание постоянной температуры - инкубатор.При использовании иммерсионного объективаобязательно его термостатирование.Поддержание баланса рН – добавление HEPES (10-25мМ) в среду с минимальным содержаниембикарбоната или подача СО2 в специальной камере,или использование специальных культуральныхсред (СО2-независимых)Уменьшение фотодеструкции – синхронизированныйс камерой затвор; снижение парциального давлениякислорода (оксираза).Уменьшение автофлуоресценции – использованиеспециальных культуральных сред (без витаминов идр.
добавок).Вещества, защищающиефлуорохромы от выцветанияВеществоКомментарииНаиболее эффективен для FITC. Также работает дляp-phenylenediamineRhodamine. Применяется в концентрации 0.1% вглицерине/PBS. Хранить в темноте, быстро разрушается насвету. Очень токсичен для кожи.DABCO(1,4-diazabi-Высокоэффективен для FITC. Несколько уступает p-cyclo-2,2,2-phenylenediamine, но более устойчив к свету и менее токсичен.octane)n-propylgallate2-mercaptoethylamineНаиболее эффективен для Rhodamine, Также работает дляFITC. Применяется в концентрации 1% в глицерине /PBS.Для окраски хромосом и ДНК с помощью propidium iodide,acridine orange, или Chromomysin A3. Применяется вконцентрации 0.1mM 2-mercaptotheylamine в Tris-EDTAСовместное использованиенескольких красителейВсе спектры флуоресценции органических красителей широкие.Поэтому при совместном использовании более двух красителей,как правило, возникает эффект перекрывания сигналов.При подборе красителей необходимо, чтобы расстояние междумаксимумами их эмиссий было не менее 40-50 нм.
Желательно –60 и более нм. Таким образом, максимальное число цветов длявизуального наблюдения составляет не более трех, дляинструментального (без специальных мер) – не более четырех.Поскольку большинство спектров флуоресценцииасимметричны («красный хвост»), то флуоресцентный сигнал открасителя с меньшим максимумом эмиссии «затекает» в каналболее длинноволнового красителя, но не наоборот.Для уменьшения эффекта перекрывания помимо подборасветофильтров используется процедура «компенсации», котораяпроводится на цифровых изображениях.Квантовый выход ирегистрация флуоресценцииКвантовый выход (Qe) рассчитывается как вероятностьизлучательного перехода.
Он всегда меньше единицы, номожет приближаться к ней. Квантовый выход флуоресцеина(в пике) – 92%.При смещении полосы возбуждения от пика квантовый выходснижается.Эффективность детектирования флуоресценции зависит отквантового выхода (возбуждение) и от полосы пропусканиязапирающего фильтра.Для оценки эффективности регистрации флуоресценции длябольшинства красителей используются специальныепрограммы – например, Spectra viewer.Спектры некоторых красителей могут изменяться при ихвзаимодействии с клеткой (как правило – сдвиг в болеедлинноволновую сторону и расширение спектра эмиссии).Подбор красителей ифильтров – Spectra viewerИнтерактивная система, позволяющая посмотреть спектрывыбранных красителей и оценить их совместимость.Наблюдение отдельной молекулыво флуоресцентной микроскопииФлуорохром – максимально стабильный(Qe/Qd>105).Объектив с максимальной светособирающейсилой (например, х60/1,45) .Квантовый выход камеры – не менее 70%;эквивалентный размер пиксела 0,1-0,15 мкм.Критерий: свечение не затухает постепенно, нопропадает внезапно и полностью.Флюоресцентные наночастицыЧастицы из полупроводниковых материалов (например,CdSe) с ядром переменного диаметра (2-10 нм).
Ширинаспектра поглощения и длина волны эмиссии зависят отразмера ядра.Строение флюоресцентнойнаночастицыРазмер ядра и свойства оболочки определяют спектрфлюоресценции.Полимерное покрытие делает частицу нетоксичной и позволяетполучать конъюгаты.Связываемые биомолекулы – например, биотин или антитела.Спектры возбуждения иэмиссии наночастицОсновные достоинства наночастиц:Большой сдвиг СтоксаШирокий спектр возбужденияВысокая фотостабильностьСимметричные спектры флюоресценцииНедостатки:относительно большие размеры, трудности конъюгации.Сравнение квантовых точеки органических красителейОдна квантовая точка (слева) связывается с несколькими молекуламиантител, поскольку имеет большой размер.Одна молекула антитела (справа) связывается с несколькимимолекулами небольших органических красителей.Цифровые камерыРабота фотодиодаОбнуление – заряд – накопление – считывание – обнулениеМаксимальный заряд фотодиода – емкость ячейкиПЗС камерыПЗС – прибор с зарядовой связью(CCD – charged coupled device)Устройство ПЗС камерыФотодиодная матрицаУстройство для экспозиции, считывания и обнуленияУсилитель выходного сигналаАналого-цифровой преобразователь сигнала (АЦП)Охлаждаемая ПЗС камера: вакуумированный корпус;система охлаждения матрицы и считывающегоустройства (ячейка Пельтье + воздушное или водяноеохлаждение)Матрица ПЗС камерыУстройство матрицы ПЗС камерыМатрицы с прямым и обратнымосвещениемКоличество и размер ячеекопределяют размер матрицыФотодиод имеет, как правило, квадратную форму и размер внесколько микрон (3-30 мкм).
Считывающее устройстворасполагается обычно под или над диодом.Размер матрицы определяется как произведение размера ячейки(фотодиода) на число строк и столбцов. Он может указыватьсяточно (мм*мм) или приблизительно (в долях дюйма).Основные характеристикиПЗС-камерыТип ПЗС (full frame, frame transfer, interline, EMCCD) и количестводефектов в матрице (grade – 0, 1, 2); наличие микролинз.Охлаждение – нет, воздушное, водяное. Температура матрицы –ниже комнатной на 10-15о; отрицательная (-25оС и ниже)Количество (строка х столбец) и размер ячеек (в мкм) – размеркадра (в долях дюйма или мм).Квантовый выход (в процентах) и спектр чувствительности.Максимальная емкость (заряд) ячейки – в тысячах электронов.Разрядность АЦП (системы считывания) – 8, 12,14 или 16 бит.Темновой ток (электронов на ячейку в секунду).Частота считывания – МГц (0.5-20).
Может быть переменной.Шум считывания (электронов на ячейку).Лекция 10Цифровая микроскопия:характеристики камерполучение, оцифровка ипервичная обработкаизображенияОсновные характеристикиПЗС-камерыТип камеры (full frame, frame transfer, interline, EMCCD, CMOS);наличие микролинз.Охлаждение – нет, воздушное, водяное. Температура матрицы –ниже комнатной на 10-15о; отрицательная (-25оС и ниже)Количество (строка х столбец) и размер ячеек (в мкм) – размеркадра (в долях дюйма или мм).Квантовый выход (в процентах) и спектр чувствительности.Максимальная емкость (заряд) ячейки – в тысячах электронов.Разрядность АЦП (системы считывания) – 8, 12,14 или 16 бит.Темновой ток (электронов на ячейку в секунду).Частота считывания – МГц (0.5-500).
Может быть переменной.Шум считывания (электронов на ячейку).Спектр светочувствительностиСпектры Coolsnap (3 разныхчипа)Темновой ток и шумсчитыванияТемновой ток измеряется в количестве электронов на ячейку всекунду. Его природа – тепловое движение электронов.Величина темнового тока экспоненциально зависит оттемпературы и зависит от размера фотодиода. Дляуменьшения темнового тока матрицу камеры охлаждают.Шум считывания (электронов на ячейку) есть результатотносительно быстрого «пересчета» электронов. Он зависитот конструкции матрицы и возрастает со скоростьюсчитывания (частотой).Частота считывания камер измеряется в МГц и составляет от0.5 до 20 и более МГц. Может быть регулируемой. В этомслучае шум считывания указывается отдельно для каждойчастоты.Камеры с охлаждениемОхлаждение матрицы осуществляется с помощью ячеек Пелтье.Каждая ступень снижает температуру на 10-15 град.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
