Лекции 2014-го года (1125726), страница 10
Текст из файла (страница 10)
Для идеального цифрового устройства SNRсоответствует разрядности АЦП (8 бит – 24 дБ; 12 бит – 36 дБ; 16бит – 48 дБ).На практике максимальное отношение может ограничиватьсяусловиями съемки.Зависимость отношениясигнал/шум от времениэкспозицииОтношение сигнал/шум принизкой освещенностиВ условиях низкой освещенности (при использованиикамер с охлаждением, где темновой ток практическиотсутствует) при небольших экспозициях шумсчитывания является основным источникомнеоднородностей.
Отношение сигнал/шум лимитируетсяконструкцией камеры и растет с ростом экспозиции почтилинейно.При увеличении экспозиции (времени накопления сигнала)наступает момент, когда дробовый шум (случайныевариации в потоке фотонов, космические частицы)превышает шум считывания и темновой ток. С этогоуровня отношение сигнал/шум лимитируется дробовымшумом и растет медленнее.Зависимость изображенияот времени экспозицииРеальное отношение сигнал/шум составило около 1000, хотярасчетное соотношение составляет 4000 (12-и битная оцифровка).Получение изображенияОсновные этапы:Определение необходимого разрешения (объектива иэквивалентного размера пиксела).Установка освещения (по Келеру).Настройка гистограммы яркости – подбор экспозиции инастроек камеры для получения максимального отношениясигнал/шум.Запись изображения в формате TIFF (другие нежелательны),8-16 бит на канал (в зависимости от контроллера камеры).Если прямая запись в формате TIFF с максимальнойразрядностью невозможна (режим RAW или аналогичный), тонеобходимо выяснить, как можно данный форматпреобразовать в TIFF без потери разрядности.Лекция 11Цифровая микроскопия:получение и обработкаизображения;морфометрияГистограмма яркостиГрафик, показывающий распределение пикселов поинтенсивности, называется гистограмма яркости.
Взависимости от условий съемки она может иметьразличный вид.Гистограмма яркостиГрафик, показывающий распределение пикселов поинтенсивности, называется гистограмма яркости. Взависимости от условий съемки она может иметьразличный вид.В светлом поле гистограмма имеет два или трипика, соответствующих фону и различнымобластям препарата.В режиме фазового контраста и DIC – один пик,соответствующий фону.В режиме флуоресценции – один пик, но чаще –спадающая от «0» кривая.Правильная настройка гистограммы яркостипозволяет эффективно проводить дальнейшуюобработку изображения.Типичные гистограммыФлуоресценцияФазовый контрастЗапись изображения – режимсветлого поляОпределение экспозиции – по гистограмме яркости(объект и фон), или по условиям съемки.Настройка цветового баланса – накал лампы неменее 50% от максимального.Определение достаточного увеличения объектива(эквивалентного размера пиксела).Предварительная фокусировка изображения в«живом окне».Запись изображения –фазовый контраст и DICЯркость фона должна составлять около 50-70% отнасыщения камеры, или время экспозицииопределяется условиями эксперимента (живыеклетки).При съемке живых клеток для увеличения контрастацелесообразно использование зеленого илиоранжевого светофильтра.Предварительная фокусировка изображения в«живом окне».Запись изображения –режим флюоресценцииНастройка освещения – поле, освещаемое лампой, может бытьуменьшено до эквивалентного размера матрицы камеры.Определение экспозиции – как правило, экспозицияустанавливается максимально возможная по условиямэксперимента (живые клетки).
Фиксированные препараты –экспозиция близка к насыщению камеры (стандартныепрепараты – экспозиция не менее 1-5 сек. для охлаждаемыхкамер).Настройка камеры – обычно не требуется, но для EMCCDнеобходима настройка усиления.Установка светоделителя – 100% света на камеру.Повторная съемка того же поля зрения нежелательна!Фокусировка в живом окне может быть затруднена – проверкупарфокальности надо проводить заранее.Вывод изображения на экранИзображение, записанное с динамическим диапазоном 8 бит,теоретически может быть выведено на экран полностью, но невсе его оттенки воспринимаются глазом.Изображение, записанное камерой с динамическим диапазоном12-16 бит, содержит большое количество скрытой информации,которая не отображается монитором.Светлые полутона воспринимаются глазом лучше, чем темные,поэтому изображение при выводе на экран частомодифицируется нелинейным образом (гамма-коррекция).Низкий контраст изображения может быть обусловленпрепаратом, а может быть связан с неправильной настройкоймикроскопа и камеры.Для увеличения контраста записанного изображения применяютразличные обработки.
Некоторые из них не приводят к потереинформации, а другие приводят.Яркость и контрастИзменения яркости приводят к объединению черных(затемнение) или белых (осветление) уровней на краяхгистограммы. Данное преобразование наиболее эффективнодля фазового контраста и DIC, а также полезно для«осветления» флуоресцентных изображений.Увеличение контраста (увеличение угла наклона на графикевходящие-выходящие уровни) приводит к резкомурасширению гистограммы яркости, и, соответственно, кпоявлению гомогенных областей. Поэтому увеличениеконтраста более эффективно в пространстве, превышающем8 бит.
Однако это возможно далеко не во всех программах пообработке изображения.Изменение яркости и контраста может осуществляться болееточно в 16-и битном пространстве путем установки верхнего инижнего уровней воспроизведения (min./max.).Настройка яркости иконтрастаДля настройки параметров изображения используетсягистограмма яркости.Если гистограмма яркости, соответствующая препарату, узкая,то первое, что необходимо сделать – растянуть гистограммутак, чтобы самые светлые и самые темные областиизображения соответствовали уровням примерно 240 и 20 (в8-и битной шкале).На следующем этапе (к растянутой гистограмме) применяютсяизменения яркости и контраста.В небольших пределах они, как правило, не приводят к потереполезной информации.Шкала серогоПреобразования часто проводятся в 8-битномпространстве, однако более правильная обработкадолжна проводиться в 16-и битном пространстве.Не все устройства (мониторы, проекторы) реальновоспроизводят 256 уровней серого. Наиболеераспространенное ограничение касается 20 нижнихи 15 верхних уровней – они выглядят как черный ибелый цвет соответственно.
Это следуетучитывать при растяжении гистограммы.При гамма-коррекции число уровней в той частиизображения, которая оказывается сжатой,уменьшается. Значительная гамма-коррекция(больше 2) может создавать гомогенно окрашенныеобласти.Гамма-коррекцияГамма коррекция – нелинейное преобразование, котороеприводит к растяжению одной части гистограммы и сжатиюдругой части.
Гамма меньше 1 – растяжение светлых полутонов;гамма больше 1 – растяжение темных полутонов.Гамма-коррекцияГамма меньше 1 – растяжение светлых полутонов;гамма больше 1 – растяжение темных полутоновКоррекция яркости и контрастаисходноегамма +яркость +яркость +контраст +Неоднородности поля зренияВиньетирование.Неравномерное освещение поля зрения (сцены).Помехи в оптическом пути и загрязнения на входномокне камеры.Дробовый шум (при низкой освещенности).Неравномерный фиксированный фон (дефектныепикселы).Нелинейная светочувствительность матрицы иэффект «затекания» при насыщении.ВиньетированиеВиньетирование – затемнение изображения по краям кадра.Причины: зависимость освещенности от угла падения света(пропорциональна косинусу в четвертой степени);механические (косой свет затемняется из-за несовершенстваоптической системы); оптические (рассеяния косого света намногочисленных поверхностях линз); зависимостьчувствительности фотодиодов от угла (удаляется с помощьюмикролинз).В микроскопии эффект виньетирования зависит от угловогоразмера матрицы камеры, и возрастает с ростом ее полязрения.
Виньетированием можно практически пренебречь,когда поле зрения камеры составляет не более 1/3 видимогополя зрения. При больших размерах необходима коррекция.Она проводится через коррекцию на плоское поле (flat-fieldcorrection) или более сложными способами.Коррекция на плоское поле увеличивает шум, обусловленныйсобственными параметрами камеры.
Поэтому ее применениево флуоресцентной микроскопии нежелательно.Вычитание фонаПроцедура вычитания фона применяется при флуоресцентноймикроскопии в случаях неравномерного освещения кадра.Вычитание фона не может быть применено длясветлопольного, фазовоконтрастного и DIC изображений.Для вычитания используется изображение, записанное с тойже экспозицией, что и в опыте, но полученное с участка, несодержащего флуоресцирующих структур.Для исправления дефектов, наблюдаемых при записисветлопольного, фазовоконтрастного и DIC изображенийприменяется коррекция на плоское поле зрения (flat-filedcorrection).Коррекция на «плоскоеполе зрения»Коррекция на плоское поле зрения позволяет удалить изизображения значительные неоднородности изображения,вызванные:(а) неравномерностью освещения препарата; (б) наличиемзагрязнений в оптическом пути микроскопа; (в) наличиемзагрязнений на окне камеры.Коррекция эффективна в тех случаях, когда интенсивностьосвещения велика, и велика неоднородность фона (например,при фазовом контрасте, DIC).При коррекции на плоское поле зрения уменьшаетсяотношение сигнал/шум для участков с равномерным фоном засчет того, что собственный шум камеры учитывается два раза.Поэтому она малоэффективна для флуоресцентныхизображений.Опорное изображение длякоррекции на «плоское полезрения»Для коррекции на плоское поле зрения в проходящем светенеобходимо найти область препарата, полностью свободнуюот загрязнений и от каких-либо структур.Часто это невозможно, тогда в качестве суррогата используютдефокусированное изображение с максимально однороднойобласти препарата.В режиме флуоресценции фотографируется стандартныйгомогенно флуоресцирующей препарат (например, урановоестекло, кювета с красителем) или равномерный фон на стекле.Для уменьшения шума необходимо сделать несколько кадровс небольшим сдвигом (не менее 15 для флуоресцентногопрепарата и не менее 3 для светлого поля), и затем ихусреднить перед преобразованием.
Это помогает уменьшитьдробовый шум и шум считывания.Коррекция на «плоское поле»(flat-field correction)При неравномерном освещении поля зрения делаетсяконтрольный снимок – участок, где нет препарата.Коррекция состоит в том, что полученное изображение делятна изображение фона:Iиз./ Iфон * const. = Iрез.Величина множителя (const.) определяется как средняяинтенсивность изображения. Операция проводится в 16-ибитном пространстве.Усиление фазовогоконтрастаИсходныйУсиление в 50 разОбработка изображения вмикроскопииНедостатки записанного изображения:1.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
