Лекции 2014-го года (1125726), страница 7
Текст из файла (страница 7)
Электроды – вольфрам.Рабочее давление – около 30 атм. Мощность – 100 Вт.Лекция 8Флуоресцентная микроскопия:источники света, объективы,красители и их использованиеДомик ртутной лампыСпектр свечения ртутной лампыСпектр свечения – квазилинейный, он расширен за счетвысокого давления паров ртути.Максимумы – 365 (10,7%), 405 (4%), 436 (12,6%), 546 (7,1%) и 579(7,9%) нм.Яркость ртутной лампы вразных областях спектраКрасительВозбуждающийфильтрДихроичноезеркалоМощность,мВт/см2DAPI365/10395 LP23,0CFP436/25455 LP79,8GFP/FITC470/40495 LP32,8YFP500/24520 LP20.0TRITC/Cy3546/12560 LP43,1Texas Red562/40595 LP153,7mCherry587/25605 LP80,9Cy5640/30660 LP9,1Эксплуатация ртутной лампыРтутная лампа сверхвысокого давления работает отисточника постоянного тока и поджигается большим током.Лампа должна располагаться вертикально, радиаторомвверх.
Дно домика лампы не может быть ближе, чемнесколько см к поверхности стола.После поджига лампа выходит на стационарный режим втечение нескольких минут. Полная стабилизация дугизанимает не менее 20 минут. Юстировка лампыпроизводится только после ее стабилизации.После выключения лампа может быть повторно включена неранее, чем через 30 минут.Время эксплуатации (НВО103W/2) – около 300 часов.Окончание эксплуатации определяется по увеличениювремени поджига и/или падению яркости более, чем на 10%.Сравнение ксеноновой, металлгалидной и ртутной лампРтутная лампа сверхвысокого давления имеет квазилинейныйспектр. Значительная часть энергии выделяется вультрафиолете. Срок службы – около 300 часов.Металл-галидная лампа имеет сходный спектр, но с меньшимипровалами между линиями. Срок службы – порядка 1000часов.
Стоимость в несколько раз больше.Ксеноновая лампа имеет практически равномерный спектр ввидимой области, но большая часть энергии выделяется винфракрасном свете. Срок службы – около 300 часов.Стоимость больше, чем у ртутной лампы.Относительная яркость НВО-100 и ХВО-75:в сине-зеленой области ХВО немного ярче; в желтой – НВОярче в несколько раз.Лазерные источники светаГазовые лазеры (аргоновый, гелий-неоновые, криптоновый)– полностью устарели, но продолжают использоваться вприборах, выпущенных 4-5 и более лет назад. Основнойнедостаток – сравнительно небольшая продолжительностьжизни и необходимость периодической юстировки.Твердотельные лазеры – имеют большуюпродолжительность жизни, более компактны.
Как правило,работают в импульсном режиме. Также требуют юстировки.Диодные лазеры – значительно дешевле, имеют оченьмалые размеры, продолжительность жизни не менее 10000часов, не требуют юстировки. Волновой фронт не вполнекогерентен. Работают в непрерывном режиме.Твердотельные лазеры с диодной накачкой.Для присоединения лазера к обычному микроскопутребуются специальные устройства (scrambler), полностьюразрушающие когерентность волнового фронта.Примеры твердотельныхлазеровТвердотельный лазер сдиодной накачкой (DPSS)Конструкция лазера зависит от длины волны. Общий принцип –накачка твердотельного резонатора с помощью светодиода.На выходе из резонатора – коллиматор пучка и ИК фильтр.Лазерная указкаДиапазон мощностей – 1-1000 мВт. Для микроскопии – 50-200 мВт.Основные длины волн: 365 нм; 405 нм; (445 нм; 473 нм); 488 нм;532 нм; 561 нм; 594 нм; 635-640 нм.СветодиодыСравнительно новые источники освещения (в микроскопииприменяются с 2006 года).Светодиод излучает в ширине около 30-40 нм, мощность –порядка 10-200 мВт.Осветители в виде комплектов светодиодов выпускаютсянесколькими фирмами.Яркость освещения – несколько ниже, чем у ртутной лампы, нобольше, чем у галогеновой лампы.Преимущества: регулируемая мощность, высокаястабильность, быстрое переключение длин волн; длительныйсрок службы (не менее 20000 часов).Сравнительная характеристикаисточников светаОбъективы дляфлюоресцентного микроскопаТипы объективов: Plan; PlanFluor; SuperFluor;Planapo; TIRF objectives (NA>1,45)Требования:1.
Большая светособирающая сила объектива (CCO).ССО измеряется как отношение числовой апертуры (NA) кувеличению.Яркость изображения при флуоресцентной микроскопиипропорциональна четвертой степени числовой апертуры.Таким образом, использование при одинаковом увеличенииобъектива c NA= 0,75 по сравнению с NA=0,65 увеличиваетяркость изображения почти в два (в 1,77) раза; увеличениеапертуры с 0,85 до 1,2 дает выигрыш в 4 раза.Максимальная ССО – у объективов х20/0,75, х40/1,3.Объективы дляфлюоресцентного микроскопаВысокое светопропускание объектива в коротковолновойчасти спектра (λ<430 нм) необходимо для работы скрасителями, возбуждающимися в ближнем УФ свете(например, DAPI, красители для определения кальция и др.).Этому условию плохо удовлетворяют планапохроматы,поэтому наибольшее распространение получилифлуоритовые объективы.При использовании нескольких красителей с далекоотстоящими друг от друга спектрами необходимость свестик минимуму аберрации привела к разработке специальных«суперапохроматов» - объективов, для которых аберрацииисправлены во всем диапазоне видимого спектра (400-750нм) и ближнем ИК спектре.Сочетание красителей ифильтровСветофильтры выделяют для наблюдения небольшую частьспектров возбуждения и эмиссии.Правильный подбор селективных светофильтров можетуменьшить эффект «затекания» сигнала.Спектр пропускания светофильтров вкубе – двойной набор (double set)Перекрывание сигналовПри одновременном использовании нескольких флуорофоровосновная проблема состоит в перекрывании сигналов.
Величинаперекрывания зависит от спектров красителей и применяемыхсветофильтров.Конфигурации наборовсветофильтровМногоцветный куб позволяет получить цветное изображение.Набор Пинкеля (Pinkel set) требует одного колеса с фильтрами и двухмногополосных фильтров – светоделителя и запирающего фильтра.Набор Седата (Sedat set) требует двух колес с фильтрами. Колесо сзапирающими светофильтрами устанавливается перед камерой.Варианты комплектациисветофильтровФлюоресцентные красителиКрасители для нуклеиновых кислот (РНК, ДНК).Мембранные красители органелл (митохондрий,АГ, лизосом и др.).Для конъюгирования с антителами, нуклеотидамии др.Сенсоры (рН, окислительно-восстановительныйпотенциал, ионы кальция, натрия)Флюоресцентные белки.Красители для исследования фёрстеровскогопереноса энергии (FRET).Основные характеристикифлуоресцентных красителейКоэффициент экстинкции – ε (20000-200000 М-1см-1)Квантовый выход – Qe (20-90%). Флуоресцеин – 92%.Среднее время высвечивания флуоресценции – τ (0,5-20 нс).Флуоресцеин – 4,5 нс.Стабильность – величина, обратная вероятности фотодеструкции(отношение Qe/Qd).
Флуоресцеин: Qe/Qd = 3х104.Спектры поглощения и испускания – максимумы, ширина наполувысоте (FWHM), сдвиг Стокса (флуоресцеин и ФИТЦ – 24 нм;GFP – около 20 нм).Все спектры эмиссии органических красителей широкие. Поэтомупри совместном использовании нескольких красителей можетвозникать эффект перекрывания сигналов.
Сигнал от красителя сменьшим максимумом эмиссии «затекает» в канал болеедлинноволнового красителя.Характеристики некоторыхфлюорохромовСтабильностьфлуоресцентных красителейПримеры часто употребляемыхфлюоресцентных красителейЦианиновые красителиКрасители достаточно стабильны, но имеютнебольшой сдвиг Стокса.Красители семействаAlexaFluorНаиболее стабильные из органических красителей(Alexa488, Alexa 555, Alexa 568, Alexa 647). Имеютнебольшой сдвиг Стокса и различный коэффициентэкстинкции.Флюоресцентные белкиНеобходимые характеристики:- спектры возбуждения и эмиссии- время и эффективность созревания (folding)- коэффициент экстинкции и квантовый выход- фотостабильность (для пролонгированных экспериментов)- изоэлектрическая точкаGFP и его мутанты:Yellow FP, EYFP (514/527 nm)Green FP, EGFP (488/509 nm)Cyan FP, ECFP (475 nm)Blue FP, EBFP (448 nm)Красные флюоресцентные белки (возбуждение – 550-590 нм,флюоресценция 580-640 нм) – очень много, но они менеестабильны, чем производные GFP.Зеленый флуоресцентныйбелокНобелевская премия,2008Осама Симомура, МартинЧалфи и Роджер Тсьен.Выделен из медузы Aequoreavictoria, экспрессирован впро- и эукариотах.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
