А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 169
Текст из файла (страница 169)
Перед работой с изотопами необходимо пройти медицинскую комиссию и сдать зачет по технике безопасности для работы с радиоактивностью. Таблица П.б Характеристика изотопов, применяемых в биологических исследованиях Специфическая ахтивносп Период полураспада (Тз/,) Обычное содержаззие в соединениях. М Бк/моль Тип распада Энергия МзВ Теоретическпй максимум, ТБк/атом Тритий ('Н, Т) 12,26 лет 846,0 10' — 1О" 0,018 Углерод-14 ('«С) 5568 лет 1 — 10' 0,155 2,3 Сера-35 (мб) 87,2 суг 55,5 1 — 10' 0,167 Хлор-36 ("С!) 4„4 1О' 10 — 10' 0,714 Фосфор-32 ("Р) 14,3 суг 340,8 1О' 10 — 10в 1,710 Иод-131 ('и1) 8,06 суг 599 О 10з 0,810 Иод-125 (зн1) 60 сут 80 6 10з 10з — 104 0,035 Основные требования по технике безопасности при работе с радиоактивными изотопамн. 1.
Лаборатория должна быть приспособлена для работы с требуемым видом изотопа. Работать с летучими веществами ('Н,О) следует только в вытяжном шкафу. Необходимо контролировать используемое количество изотопа и его изменение. Для отбросов надо иметь готовые контейнеры. Для мытья рабочего места применяют детергенты. 2. В изотопной лаборатории запрещается есть, пить и курить. 3. Запрещается набирать жидкости в пипетки ртом.
4. Необходимо носить рабочий хшлат, перчатки и защитные очки. 5. Все склянки с изотопами должны быть помечены знаком «радиоактивность« с датой приготовления. б. По возможности сяедует использовать одноразовую пластмассовую посуду (пипетки, пробирки, сцинтилляционные стаканы) и после использования складывать их в соответствующий контейнер для радиоактивных отходов. 7. После опыта всю использованную лабораторную посуду следует промыть и дезактивировать для дальнейшезю использования.
8. Необходимо вести строгий учет всех использованных изотопов в специальной книге. 9. После работы следует убрать рабочее место и перед уходом из лаборатории тщательно вымыть руки. 10. В случае любых инцидентов, связанных с разбрызгиванием или разлитием изотопа, надо сообщить всем работающим в комнате и преподавателю. Тритий и '«С в количествах, используемых в экспериментальной микробиологии.
не представляют радиационной опасности. Однако, учитывая очень длительный период полураспада иС (более 5 тыс. лет), он может надолго задержаться в организме, включаясь, например, в ДНК„и поэтому представляет собой опасность для здоровья. ПРИЛОЖЕНИЕ 4 СРЕДЫ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ РАЗЛИЧНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ Среды стерилизуют при 1,0 или 0,5 ати в зависимости от наличия в них витаминов или других термолабильных факторов. Сахара стерилизуют отдельно при 0,5 ати в течение 15 — 30 мин в виде концентрированных растворов (40%) и добавляют в среды при посеве.
СРЕДЫ, ОБЕСПЕЧИВАЮЩИЕ РОСТ РАЗЛИЧНЫХ ХЕМООРГА НОГЕ ТЕРО ТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ 1. Мясопептонный бульон (МПБ). Основой для приготовления МПБ служит мясная вода, которую готовят следую- и!им образом: л1ясо освобождают от костей, жира и сухожилий, мелко нарезают или пропускают через мясорубку.
500 г полученного мясного фарша заливают 1 л водопроводной воды и оставляют для экстракции при комнатной температуре на 12 ч или в термостатепри30 С на 6ч, или притемпературе37 — 39 С на2ч, а при 50 С вЂ” на 1 ч. За это время из мяса экстрагируются различные вещества, в том числе водорасгворимые витамины. Затем мясо отжимают через марлю, и полученный настой кипятят 30 мин. При этом свертываются белки.
Остывшую массу фильтруют через ватный фильтр и доливают водой до первоначального объема. К полученной мясной воде добавляют 1% понтона и 0,5 % ХаС!. МПБ — богатая питательная среда, но она почти не содержит углеводов. В случае необходимости их добавляют к МПБ чаще всего в количестве ! — 2 г на 100 ьць МПБ стерилизуют при 1 ати 20 — 30 мин. 2.
Солодовое (неохмеленное пивное) сусло. Очень хорошая среда лля развития некоторых молочнокислых и уксуснокислых бактерий, дрожжей, мицелиальных грибов и других представителей гетеротрофных микроорганизмов. Сусло содержит до 16% сахаров, преимущественно мальтозу (80%), и частично глюкозу, декстрины, азотистые вещества (до 6 — 7% от общей массы сухого остатка, витамины (преимущественно группы В), минеральные соли и органические кислоты.
Зерна ячменя замачивают в холодной воде и проращивают при 35 С. После того, как ростки станут вдвое больше длины зерна, последние высушивают до воздушно- сухого состояния (можно при слабом подогрево) и получают солод. Сусло готовят следующим образом: 250 г размолотого солода заливают 1 л водопроводной воды, нагревают до 48 — 50 'С и поддержива|от эту температуру в течение 30 мин, непрерывно помешивая смесь, чтобы избежать образования комков. Затем температуру поднимают до 55 — 58'С и поддерживают ее на этом уровне до полного осахаривания крахмала, т.е.
до тех пор, пока реакция остывшей пробы с йодом не будет отрицательной. При указанном режиме происходит также гидролиз белков до аминокислот и пептидов. Полученный экстракт отфильтровывают через вату или бумажный фильтр. В филь- трате определяют концентрацию сахаров, пользуясь ареометром Беллинга, градусы ('Б) которого примерно соответствуют процентному содержанию сахара в растворе. До требуемой концентрации сахара сусло доводят водопроводной водой. Для культивирования микроскопических грибов чаше все~о используют 3 — 4 'Б сусло, для дрожжей — 6 — 8 'Б, лля уксуснокислых бактерий 4 — 6'Б, а для наиболее требова- 569 тельных молочнокислых бактерий — 8 — 12 Б сусло. Сусло стерилизуют при 0,5 атп 20 — 30 мин. 3.
Среда бульон — сусло — агар (БСА). Мясо-понтонный бульон смешивают с равным обьемом б Б сусла и добавляют 2 г/л агара. Среду стерилизуют при 0,5 ати 20 — 30 мин. 4. Целыюе молоко. Молоко содержит все питательные вещества, необходимые для развития гетеротрофных микроорганизмов: лактозы — около 4,5%, белков — 5,0%, минеральных соединений — 1%, витамины. В молоке без добавок содержится примерно 0,01% своболных аминокислот, что составляет менее, чем 20% аминокислот, которые содержатся в средах, обеспечивающих оптимальный рост бактерий. Для того чтобы добиться нормального роста на среде с казенном молока в качестве основного источника азота, у организмов должна быть определенная способность к протеолизу. Молоко нагревают до кипения, наливают в цилиндры и ставят на 10 — 20 ч в холодильник.
По истечении этого времени сливают сливки, разливают частично обезжиренное таким образом молоко по пробиркам, закрывают их ватными пробками и стерилизуют при 0,5 ати 30 мин. 5. Обезжиренное молоко. Для приготовления питательных сред часто используют обезжиренное молоко (так называемый обрат), поскольку жир в молоке может неблагоприятно влиять на рост некоторых микроорганизмов. Цельное молоко сепарируют и далее поступают так же, как при использованш.
цельного молока. Обезжиренное молоко можно также получить путем центрифугирования (!5 мин при 700 — 1500 8) или кипячения с последующим отстаиванием в холодильнике в течение 2 сут. б. Гндролнзованное молоко (по Богданову). Берут 1 л прокипяченного и остуженного до 45 'С обезжиренного молока, устанавливают рН 7,6 — 7,8, добавляют 0,5 г порошка панкреатина (предварительно разведенного в небольшом количестве теплой воды) и через несколько минут 5 мл хлороформа. После этого сосуд тщательно всгряхивают и помешают на 3 сут в термостат при температуре 40 С при ежедневном перемешивании жидкости.
По истечении указанного срока для удаления хлороформа бутыль открывают, жидкость фильтруют, разбавляю~ ь 2 — 3 раза водопроводной водой и доводят рН до 7,0 — 7,2. Среду стерилизуют при 0,5 ати 30 мин. 7. Молочно-пептонная сыворотка. Обезжиренное молоко, нагретое до 40 С, свертывают сычужным ферментом (на 1 л вносят 0,1 г препарата, растворенного в 10 мл воды) и выдерживают при указанной температуре в течение 1 ч. Затем сгусток разбивают стеклянной палочкой и жидкость нагревают до 80 С.
Сыворотку процеживают через редкий холст и добавляют 1% пептона. Для осаждения белков сыворотку нагревают в автоклаве 20 мин при 0,5 атп и горячей отфильтровывают через вазный фильтр. Среду стсрилизуют при 0,5 ати 15 мин. 8. Гицролизат казеина. Первый способ: 20 г казеина заливают 200 мл воды, добавляют 10 мл концентрированной Н2801 и выдерживают в автоклаве 4 ч при 1,5 ати. Второй слособ: к 200 г казвина добавляют 280 мл б н раствора НС1 и смесь кипятят с обратным холодильником 18 ч. Полученный гидролизат нейтрализуют 50%-м раствором ХаОН до рН 7,0, фильтруют через бумажный фильтр и стерилизуют при 0,5 азг 30 мин. Содержание аминного азота в гидрслизате, полученном таким способом, составляет 700 — 1000 мг на 100 мл. Его добавляют к средам в таком количестве, чтобзс концентрация по аминному азоту составляла 10 — 30 мг на 100 мл. Следует имезь ь вицу, что при кислотном гидролизе полностью разрушается триптофан, в достаточн; большой степени цистеин и незначительно серии и треонин.
Имеется готовый преп.- рат гицролизата казвина. Его вносят в среды в количестве от 0,1 до 1,0 г на 100 зш з зависимости от потребностей микроорганизмов. 570 9. Дрожжевая среда. Используется для культивирования различных представителей гетеротрофных микроорганизмов. Основа дрожжевой среды — дрожжевая вода. Для ее приготовления 70— 100 г свежих прессованных дрожжей или 7 — 1О г сухих дрожжей кипятят 30 мин в 1 л водопроводной воды. Затем массе лают отстояться в высоком цилиндре на холоду, жидкость декантируют и фильтруют через вату.
К фильтрату добавляют 1 л воды, еще раз кипятят 30 мин и вновь фильтруют. К полученнойдрожжевой воде добавляют К,НРО„ (0,1%) и )чаС! (0,5%), а в случае необходимости углеводы (1 — 2%). Доводят рН полученной среды до 6,8 — 7,2. Срелу стерилизуют при 0,5 ати 20 — 30 мин. 10. Дрожжевой автолизат. Дрожжи Юассйаготусез сегеиз!ае содержат 40 — 60 % азотистых веществ, а также ряд ферментов, способствующих их самопереварнванию.
При автолизе дрожжей образуются продукты, харакгерные для триптического переваривания животных белков. Для приготовления дрожжевого автолизата следует выбирать емкость с таким расчетом, чтобы автолизат занимал около '/з объема посуды. 40 1 свежих прессованных дрожжей (или 10 г сухих дрожжей) разводят в 100 мл воды, добавляют несколько кристаллов тнмола или ! — 2 мл хлороформа. Смесь выдерживают в термостате при 50 — 55 С трое суток. По мере разжижения дрожжей смесь встряхивают для равьюмерного прогревания (1 — 2 раза в сутки).
За это время клетки дрожжей отмирают, а ферменты остаются активными и гидролизуют белки, а также другие биополимеры. Конец автолиза характеризуется полным разжижением дрожжей, Автолизат должен иметь коричневый опенок и приятный запах. Полученный автолизат хорошо перемешивают и кипятят 20 мин на слабом огне (для сверпявания нерасщепившихся белков и лучшего фильтрования), а затем фильтруют через бумажный фильтр. Автолизат стерилизуют при 0,5 ати 15 мин и сохраняют в холодильнике. 11.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
