А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 168
Текст из файла (страница 168)
В течение некоторого времени записывают уровень дыхания кчеток в отсутствие субстрата (эцдогенное дыхание). Затем через отверстие в полярографической ячейке шприцем вводят субстрат дыхания. Концентрации клеток и субстрата подбирают экспериментально с тем, чтобы скорость дыхания суспензии не была слишком низкой (увеличивает время эксперимента) и слишком высокой (занижается уровень дыхания клеток и часто не хватает времени для внесения последующих добавок). Выбирают концентрацию клеток и скорость движения пензы самописца, чтобы изменения тока шли примерно под углом 45 к оси абсцисс. В течение одного эксперимента можно внести последовательно субстрат дыхания. его ингибитор, другой субстрат дыхания и ингибитор питохром-оксидазы (например. сукцинат, ротенон, аскорбат и тетраметилпарафенилендиамин, затем цианид или азид). Внимание! Ингибиторы дыхания являются сильнейшими ядами и работать с нила нужно, соблюдая все правила техники безопасности.
По окончании каждого эксперимента следует тщательно отмывать электрод дистиллированной водой, не менее трех раз меняя воду и используя магнитную мешалку. Расчет результатов. Полярографическая ячейка с вмонтированным электродом имеет внутренний объем 1,5 мл. Из этого объема следует исходить при подготовке растворов субстратов дыхания„которые вносят в конечной концентрации 10 ' — 10 ' й1.
При приготовлении свежей пробы в пробирку вносят суспензию микроорганизмов в буфере или минеральной среде без источника углерода. Отмеряют 3 мл суспензии и наливают ее в ячейку до образования высокого л~сниска. Осторожно вставляют электрод, следя за тем, чтобы внутри ячейки не оставалось пузырьков воздуха. На дне ячейки должен находится маленький лгагнитик. Ставят ячейку с укрепленным электродом на магниз= ную мегпалку и включают ее.
Порядок внесения добавок определяется в каждом конкретном случае в зависимости от целей эксперимента. фаа(и~нтю и лаинципы ~дьоты нд нви Для изучения принцигюв проточного культивирования подходит любой ферментер, в котором при соблюдении стерильности проводимого процесса имеется возможность автоматически регулировать температуру, скорость перемсшивания, количество подаваемого стерильного воздуха, рН и скорость подачи стерильной среды в ферментер. Описание фермеитера. Стенд «Микроферм» МА-114 (фирмы Нью-Браунсвик, США) (рис.
П.17) представляет собой компактный настольный прибор, предназначенный Лля массового культивирования микроорганизмов в периодическом и непрерывном режиме. Используя этот прибор, можно выращивать большое число различных видов микроорганизмов в строго контролируемых условиях. Ферментер полносзтяо оборудован приборами для поддержания и контролирования температуры, скорости перемешивания, аэрации и рН. Клетки культивируют в толстостенном стеклянном сосуде, выдерживающем многократное автоклавирование. Сосуд фиксируется на стенде с помощью двух пружинных зажимов с винтами, позволяющими быстро отделять культиватор от стенда. Чтобы уменьшить возможность занесения в ферментер посторонней микрофлоры, мешалка соединена с приводом мотора при помощи двух постоянных магнитов.
Лопасти мешалки обеспечивают эффективное персмешивание содержимого ферментера в радиальном направлении и могут быть легко приспособлены к любому уровню среды в сосулс. Высокоточный мотор с калиброванным электрическим тахометром позволяет устанавливать скорость вращения мешалки от 100 до 2000 об/мин. Контролирующий прибор поддерживает скорость вращения на заданном уровне независимо от скачков напряжения в сети или вязкости культуры с помощью механизма, работающего по типу обратной связи.
Стенд снабжен газометром, позволяющим учитывать и регулировать количество подаваемого в прибор воздуха или другого газа (СОь аргона). Регулирование температуры жидкости в ферментере осуществляется путем подачи горячей воды из термостата прибора через замкнутую систему погруженных в культуральную жидкость трубок.
Охлаждение происходит водопроводной водой. Измерение температуры ведется с помощью термопары, помещенной внутрь сосуда. Кислотность среды регулируется автоматически специальным прибором для контроля рН. Два электрода (измерительный и сравнения) монтируются на верхней крышке сосуда (рис. П.15) перед стерилизацией и затем с помощью проводов соединяются с соответствующими гнездами прибора. Устройство электродов данного прибора позволяет стерилизовать их в автоклаве при избыточном давлении 1 ати, однако для других типов электродов может быть с успехом применена стерилизация спиртом. Регулирование рН осуществляется подачей щелочи или кислоты через два перистальтических насоса, вмонтированных в прибор. Следует подобрать заранее и простерилизовать вместе с сосудом силиконовые шланги подачи кислоты и щелочи нужного диаметра и необходимой длины.
Подготовка сосуда к стерилизации. Перед стерилизацией стеклянный сосуд надо чисто вымыть, ополоснуть дистиллированной водой, залить средой для культивирования. В верхнюю металлическую часть ферментера (см. рис. П.16) вкрутить измерительный и сравнительный электроды контроля рН (перед каждой стерилизацией следует проверять уровень жидкости внутри электродов и при необходимости доливать свежий раствор электролита). Перед тем как соединить стеклянный сосуд ферментера с металлической верхней частью, нужно с двух сторон смазать ут|лотнительное резиновое кольцо вакуумной смазкой. Крышка стеклянного сосуда фиксируется с помощью шести винтов — «барашков», К отверстиям для ввода кислоты и щелочи присоединяют силиконовые шланги, в свободные концы которых вставляют ватные пробки и фольгу.
В шланги, подающие и отводящие воздух, помегцают воздушные фильтры, нагюлненные стеклянной ватой (воздух через фильтры должен проходить свободно). Устройство прибора 565 5 3 4 4,5192021 22 8 9 12 10 11 13 14 15 1б 17 18 1 В дает возможность использовать для аэрации магистральный сжатый воздух, который стсрилизуется, проходя через нагретые до 130 'С фильтры со стеклянной ватой. Возду . выходящий из ферментера, также автоматически стерилизуется с помощью фильтра. При подготовке ферментера к стерилизации необходимо убедиться, что все трубки.
опущенные ниже уровня среды, заполняющей его, были плотно закрыты зажимамп. 566 Рис. П.17. Схема фсрментера «Микраферм МА-1!4» фирмы Нью-Браунсвик (США); .О. 25 А — вил спереди: 1 — шанд прибора; 2 — сосу" 38 ферментера на 14 л; 3 — привод мешалки; 4— 27 фильтр подачи воздуха; 5 — фильтр выхода воздуха: б — линия подачи воды из термостата; 7 — кронвь тейп крепления сосуда с зажимамн; 8 — тумблер и 29 30 контрольная лампочка включения прибора; 9— 37 тумблер и контрольная лампочка вкхю ~ения нагре- 3 ьзтеля; 10 — тумблер и контрольная лампочка вклкн 31~ Зб ченил перемешивания; 11 — тумблер и контрольная О лампочка включения охлаждения; 12 — регуллтог 35 температуры„' 13 — регулятор числа оборотов мешалки; 14 — тахометр скорости врашеняя мешалли; 15 — автоматический регистратор температур»к 32 ЗЗ 1б — указатель расхода воздуха; 17 — воздушныс манометр; 18 — регулятор давления воздуха.
Б— вид слева: 19 — гнездо заземления; 20 — гнезде датчика непогашения; 21 — гнездо датчика уровня жидкости в сосуде; 22 — гнездо термистора: 23 — гнездо термометра.  — верхняя крышка сосуда: 24 — конденсатор водяных паров; 25— выход воздуха; 2б — вход воздуха; 27 — отверстие лля датчика пеногашения„28 — отверстие лзх датчика уровня жидкости; 29 — отверстие для термистора; 30 — лиюш подачи воды; 31— отверстил для добавок; 32 — патрубок для добавок; 33 — патрубок слива жидкости; 34 — отверстие для термометра; 35 — отверстие для палачи кислоты, щелочи и пеногасителя; Зб — засевной лючок„37 — отверстие для добавок; 38 — отверстие для электродов измерения рН; 39— заземление чтобы избежать вытеснения среды из сосуда при стерилизации.
Кроме того, необходимо следить за тем, чтобы отверстия, до которых среда не доходит, были свободны лля выхода пара во время стерилизации (их затыкают ватными пробками). Ферментер стерилизукп в вертикальном положении в автоклаве при давлении до 0,5 ати от 30 мин до 1 ч в зависимости от состава и количества среды в сосуде. После стерилизации во избежание вспенивания содержимого необходимо убедиться, что избыточное давление в автоклаве полностью отсутствует.
Альтернативно можно простерилизовать сосуд и среду отдельно. Закончив стерилизацию, сосуд укрепляют на стелл и зажимают прижимными планками. С помощью специальных шлангов подводит нагрсвающую/охлаждающую воду, вставляют металлические фильтры подачи воздуха в предназначенные для них отверстия, подсоединяют шланги конденсационной волы, вставляют два терморезистора (термопары) контроля температуры, подсоелиняют рН-электролы к прибору контроля рН„а шланги подачи кислоты и щелочи пропускают через перистальтические насосы и опускают (стерильлс„козле газовой горелки!) в стерильныс растворы кислоты и щелочи. Подсоединят мешалку ферментера к мотору и включают прибор.
После достижения заданной температуры производят посев культуры, используя специальное отверстие (лючок). Необходимо соблюдать максимум асептики: протирать лючок спиртом ло и после посева с обжигом его газовой горелкой; посев производить с использованием стерильной воронки и как можно быстрее. При посеве мешалка должна быть отключена. ПРИЛОЖЕНИЕ 3 РАБОТА С ИЗОТОПАМИ ОБЩИЕ ПРИНЦИЛЫ В биологии в основном применяются изотопы с ()- и т-излучениями. Выбор изотопа определяется применяемым метолом, его удельной активностью, энергией, периолом полураспада и другими факторами, от которых зависит эксперимент. Период полураспада выбранного изотопа и его энергия определяют вил выбранного для подсчета активности инструмента и скорость засвечивания фотопленки, так же как и необходимость коррекции удельной активности радиоактивной метки в течение опыта.
р-Излучение (поток электронов) от трития и '4С можно измерять в газовой камере, присоединенной к электромстру, счетчиком Гейгера или с помощью сцинтилляционной техники. В последнее время жидкостные сцинтилляционные счетчики благодаря их удобству и чувствительности заменяют все основные виды подсчета в биологии. В нижеприведенной таблице даются основные свойства некоторых изотопов (табл. П.б). для подсчета излучения 'и! и 'м! используют гамма-счетчики. ТЕХНИКА БЕЗОПА СНОСТИ Лаборатория, в которой проводится работа с изотопами, оборудованная вытяжными шкафами и химическими столами, должна быть принята комиссией по технике безопасности.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
