Методы разделения и очистки белков (1123326), страница 5
Текст из файла (страница 5)
В связи с этим для удаления солей или смены раствораиспользуют также метод гель-фильтрации (см. ниже). В этом случаеноситель должен полностью исклю чать белки, но удерживатьнизкомолекулярные вещества. Наиболее широко применяемые дляобессоливания материалы - сефадекс G-25 или биогель Р-6. Однакотакж е как и диализ, удаление низкомолекулярных компонентов исменараствораметодомгель-хроматографииимеетряднедостатков. В первую очередь к ним относится требование кобъему образца, который не должен превышать 1/3 объема колонки.Кроме того, при гель-хроматографии исходный образец белка будетсущественно разбавляться.Перед обессоливанием белка носитель для гель-фильтрацииуравновешивают буфером. Хорош его отделения белка от солиможно достичь при довольно высокой скорости элюции.
За элюциейбелка обычно следят по изменению величины оптическойплотности при длине волны 280 нм. Присутствие солей в пробахпослехроматографииможновыявитьсоответствующимихимическими реакциями. Так, например, наличие в пробе сульфатааммония можно обнаружить, добавив к пробе хлорид бария.Появление белого осадка B a S 0 4 свидетельствует о неполномудалении аниона сульфата.8. Концентрирование белков.Существует несколько способов концентрирования белковогораствора.
Среди них:1) Ионообменная хролют ограф ия (принцип метода будетподробно обсужден ниже);2) Осаж дение белков припомощивысаливанияилиорганическими растворителями (см. выше) с последующимрастворением осадка в меньшем объеме;3) Обратный диализ - диализ против раствора с высокойионной силой, например, насыщенного раствора сульфата аммония.М елкие молекулы воды из белкового раствора свободно проходятчерез полупроницаемые стенки «диализной трубки» по градиентуконцентраций, тогда каккрупные молекулы белка остаются вдиализном мешке. Поскольку внутрь диализного меш ка при этомпроходят ионы соли, такой способ концентрирования удобен далеконе всегда, но бывает очень полезен, когда необходимо повыситьконцентрацию белка, чтобы перевести его из растворенной формы восадок (как в случае высаливания).244) Концент рирование за счет осмотических сил метод,сходный с методомобратного диализа ипредполагающийудалениеводы из диализногомеш ка с белковым растворомс помощью высокомолекулярных веществ, отнимаю щ их воду,например, полиэтиленгликоля с молекулярной массой более 20 кДа.Данный метод особенно удобен при работе с небольшими объемамиконцентрируемых растворов.
При этом можно использовать каксухое вещество, обсыпаяим диализныймешок, так иконцентрированный раствор полимера (например, 20% -ный растворполиэтиленгликоля);5) Наиболее современным и широко используемым внастоящее время считается мет од ульт рафильт рации. Онпредполагает продавливание раствора через мембрану с порамиопределенного размера под давлением 4-5 атмосфер, котороесоздается газом (чаще, азотом) в специальных ячейках, гдеконцентрируемый раствор постоянно перемешивается во избежаниезакупорки мембраны (рис. 6а). При этом все молекулы, размеркоторых меньше размера пор, проходят через мембрану, а надмембраной остается более концентрированный раствор белка.Данный метод позволяет снизить объем раствора в 10-20 раз менеечем за час, однако, скорость ультрафильтрации быстро падает сповышением концентрации белка.
Следует также помнить, чтомембрана для ультрафильтрации имеет некоторый разброс размеровпор и поэтому резкой границы пропускания молекул не существует.Чтобы весь белок был в «ультрафильтрате» или, наоборот, надмембраной в ячейке, необходимо, чтобы размеры его молекулотличались от размера пор на 30-50%.6) О беспечить быстрое прохождение мелких молекул черезпоры мембраны можно и при помощи центрифугирования.Различныефирмывыпускаютспециальныецентрифужныепробирки, во вкладыши которых помещают полупроницаемуюмембрану, способную под действием центробежных сил пропускатьмелкие молекулы (рис. 66).
Если поры в мембране таковы, что болеемелкие молекулы белка проходят через нее с «ультрафильтратом»,то можно достичь не только концентрирования, но и определенногоразделения белков.7) К одному из способов концентрирования белков можноотнестимет одлиоф илизации(обезвоживания),которыйзаключается в следующем.
Раствор белка замораживаю т притемпературе -40-70°С (или в жидком азоте) и в открытой тарепомещ аютв камеру длялиофилизации, соединеннуюсДавление4 - 5 атмМембранаПористаяподложкаУльтрафильтратМагнитная мешалкабРис. 6. Некоторые методы концентрирования белковыхрастворов, а - Ультрафильтрация в ячейке под действием давления:(1)современнаяячейкадляультрафильтрации[http://itsltd.kz/m iIlipore/filter-m em brane/5112.jpg], (2)схема еёустройства; б - ультрафильтрация в центрифужных пробирках засчет центробежного ускорения: (1) центрифужная пробирка, (2)вкладыш-резервуар, на мембрану которого наносится образец, (3)раствор низкомолекулярных соединений на дне пробирки послецентрифугирования, (4) сконцентрированный образец белка(белков).26конденсором, - отделением, в котором расположен холодильник,поддерживающий температуру -50-70°С (ниже, чем в камере длялиофилизации).
Во всей системе создается вакуум, и за счетразностипарциальногодавленияпаровводыпроисходит«перемораживание» воды из образца в конденсор. Таким образом,высушивание образца происходит путем перехода воды из твердойфазы в газообразную, минуя жидкое состояние (явлениесублимации). В итоге получают препарат белка в виде сухогопорошка, необходимую навеску которого можно растворить влюбом объеме выбранного растворителя.Все перечисленные методы имею т свои преимущ ества инедостатки,и их выборопределяетсяособенностямиконцентрируемого белка, его дальнейшим применением ипредъявляемыми к нему требованиями. Дальнейш ая очистка ифракционирование белков могут осуществляться более «тонкими»методами, к которым относятся различные виды колоночнойхроматографии.9.
Хроматографические методы разделения белков.В данном методическом пособии мы не ставим цельюпровести подробный анализ теории хроматографии, а остановимсялишьна техпонятиях и принципах методов, которыенепосредственно используются в практической работе.9.1.Общ иепринципыхроматографии.хроматографические системы обычно состоят из двух фаз:неподвиж ной фазы (которая бывает твердой или жидкой) иподвиж ной фазы (может быть жидкой или газообразной), котораядвижется относительно неподвижной фазы с определеннойскоростьюивопределенномнаправлении.Молекулыфракционируемой смеси веществ распределяются между этимифазами в зависимости от своих свойств.Распределение соединений между двумя несмешивающимисяфазами определяется коэф ф ициентом распределения (К), которыйравен отнош ению связавшегося с сорбентом вещества к количествувещества, оставшегося в подвижной фазе:Msк = ------- ,где(18)МтMs - количество вещества, связавшегося с сорбентом(моль или мг)М т - количество вещества, не связавшегося с сорбентом(моль или мг).27ВсеОчевидно, чтогдеMs+M m = M ,(19)М - общее количество вещества, подвергающеесяхроматографии.Величина К может принимать лю бые положительныезначения от 0 до со.
При К=0 молекулы вещ ества совсем несорбируются на неподвижной фазе, тогда как при К —к о веществопрактическиполностьюсорбируетсянаносителе.Прихроматографии смеси веществ важно подобрать подвижную инеподвижную фазы так, чтобы коэффициенты распределениякомпонентов смеси в них были различными.В зависимости от способа проведения хроматографическогоразделения смеси веществ выделяю т несколько методов, средикоторых:1) хроматография на бумаге2) тонкослойная хроматография на пластинах3) колоночная хро м ато гр аф и я4) хром ато гр аф и я в объем еПервые два способа в больш ейстепени применяю т дляразделения низкомолекулярных соединений: аминокислот, короткихпептидов, липидов, нуклеотидов и т.п.Хромат ограф ия в объеме не предполагает специальныхколонок.
Суспензию сорбента помещ ают в сосуд, куда добавляютраствор смеси фракционируемых веществ. Часть из них связываетсяс носителем и отделяется от веществ, оставш ихся в растворе,центрифугированием (или декантацией). Далее связавшиеся сносителем соединения можно удалить, изменив условия среды, либонепосредственно в объеме, либо поместив сорбент в колонку.Хроматографиявобъемеприменимадлялю боговидахроматографии (см.
ниже), за исключением гель-фильтрации.Для разделения белков более широко использую т различныевиды колоночной хромат ограф ии. Самая простая колонкапредставляет собой пластиковую или стеклянную трубку соспециальнымфильтромнадне,заполненнуюсорбентом.П еристальтический насос обеспечивает подачу подвижной фазы вверхнюю часть колонки (рис. 7а). Верхний и нижний концысовременнойколонки снабжены специальными адаптерами,несущими фильтры и плотно прилегающ ими к стенкам колонки. Спомощью адаптеров можно регулировать уровень жидкости надносителем.28перистальтический насосРис. 7. Х роматографическая колонка: а - общая схема; б современная колонка с адаптерами [http://im ages.google.ru].Диаметр сферических частиц различных типов носителейколеблется от ~20 до 300 мкм. Процесс хроматографическогофракционирования на таких сорбентах занимает от нескольких додесятков часов (в зависимости от размера колонки и видахроматографии).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
