Методы разделения и очистки белков (1123326), страница 12
Текст из файла (страница 12)
Ионная сила раствора белка недолжна превышать ионную силу буфера Б, которым былауравновеш ена колонка, в противном случае есть опасность, чтобелок не свяжется с сорбентом.Если электропроводностьбелкового раствора превыш ает электропроводность буфера,белковый раствор можно разбавить дистиллированной водой.На всех эт апах хром ат ограф ии не забы вайт е отбиратьпробы (-5 0 -6 0 мкл) для последую щ его анализа результ ат овхромат ограф иим ет одомэлект роф орезавполиакриламидном геле. Из каж дого белкового пика лучш еот обрат ь по 3 пробы: на подъеме, на максимуме и на спаде.62Все от обранныезаморозьте!!!ф ракцииобязат ельноподпиш ит еи2.
Нанесение белка на колонку.1) Подсоедините колонку к увикорду (Uvicord) (увикорд «проточный» спектрофотометр, регистрирую щ ий при длиневолны 280 нм изменение оптического поглощения раствора,поступающегосколонки).Регистрироватьоптическуюплотность и следить за элюцией белка удобно с помощьюсамописца, соединенного с увикордом. Пики на самописце будутсвидетельствовать об элюции белков с колонки.
Увикорддолженбытьвключензаранее, чтобыонпрогрелся.Чувствительность используемого Вами увикорда составляет-0,5-1 единицу оптической поглощения на шкалу.2) Перед нанесением белка на колонку установите насамописце базовую линию, соответствующ ую нулю оптическогопоглощения на увикорде, пропустив через его кюветунебольшой объем буфера Б.3)Нанеситебелокнаколонкуспомощьюперистальтического насоса, уменьшив скорость нанесения до 4050 мл/ч.3. Пром ывание колонки.После нанесения всей порции раствора белка промойтеколонку буфером Б. При этом будутэлюироватьсянесвязавшиеся и/или слабо связавшиеся с сорбентом белки.Скорость промывки можно увеличить до 80 мл/ч.
Обычно длятакой промывки достаточно 3-5 объемов буфера (расчет ведетсяотносительно объема колонки). За элюцией слабо связанных ссорбентом белковследите по показаниям самописца. Какправило, во фракции несорбировавш ихся белков элюируетсялизоцим (кажущаяся молекулярная масса 14 кДа).4. Элюция белков.1) Элюцию белков осуществляйте сначала буфером Б,содержащим 50 мМ N aC l.
При данной ионной силе с колонкиобычно элюируется кональбумин (кажущаяся молекулярнаямасса 77 кДа).2) Яичный альбумин элюируйте с колонки буфером Б,содержащим 200 мМ NaCl.633)Болеепрочносвязанныйссорбентомрибофлавинсвязывающий белок (кажущаяся молекулярная масса36 кДа) элюируйте буфером Б, содержащ им 500 мМ NaCl.За процессом элюции белков следите по показаниямсамописца.Не забудьте отобрать по 3 фракции (-50-60 мкл) с каждогобелкового пика для их анализа методом электрофореза!!!5.Отмывка колонки от прочно связанных белков.После окончания работы промойте колонку с ДЭАЭцеллюлозой 3-4 объемами 1 М раствором N aC l, перенеситесорбент из колонки в химический стакан и промойте колонку,все шланги и кювету увикорда дистиллированной водой.Занят ие 4.Анализ фракций, полученны х в результ ат еионообменной хромат ографии.Отобранные в ходе работы фракции проанализируйте методомэлектрофореза в полиакриламидном геле в присутствиидодецилсульфата натрия (ДСН) (см.
методическое пособие«Электрофорез в полиакриламидном геле»).64О Ф О Р М Л Е Н И Е ЗА Д А ЧИЗадачу оформите в соответствии со следующим планом:1) Название работы.2) Краткое теоретическое введение (не надо дословнопереписывать методическое пособие; необходимо описатьпринципы методов, которые Вы используете в работе).3) Цель работы.4) Ход работы.4.1. Приготовление реактивов с указанием всех навесок иобъемов, в которых их растворяли;4.2. Описание заполнения и уравновеш ивания колонки суказанием объема колонки и скорости тока буфера и егообъема при уравновеш ивании;4.3. Подробное описание всех этапов выделения белка дохроматографии на колонке;4.4.
Описание диализа с указанием:-объема буфера для диализа,-времени диализа,-концентраций, количества и объема диализуемогобелкового препарата до и после диализа;4.5. Схема подключения хроматографического оборудования;4.6. Детальное описание процесса хроматографии с указаниемсостава и объемов элюирующих растворов.5) Результаты и их обсуждение.5.1.
Приведите профиль элюции белков (хроматограмма суказанием всех этапов хроматографии) и подробноопишите его;5.2. Приведите результаты электрофореза полученных впроцессе хроматографии фракций и подробно опишитеэлектрофореграмму.5.3. Постадийно проанализируйте результаты, полученные входе выделения и хроматографии. Детально сравнитеданные хроматограммы и электрофореграммы, а такжедорож ек электрофореграммы между собой.Проанализируйте, чем отличаются полученные вамирезультаты от тех, что вы ожидали получить.
Если что-тоне получилось, постарайтесь понять, почему. Предложитесвою усоверш енствованную методику выделения иочистки яичного альбумина на ДЭАЭ-целлю лозе илидругом носителе.657) Выводы.Выводы должны в очень сжатой форме отражать полученныеВами результаты.ЛИТЕРАТУРА1. Березов Т.
Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия М.,М едицина, 1998.2. Бохински Р. Современные воззрения в биохимию. М., Мир,1987.3. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. М. Мир, 1982.4. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочникбиохимика. М., Мир, 1991.5. Кольман Я., Рем К.-Г. Наглядная биохимия. М., Мир, 2000.6. Кочетов Г. А. Практическое руководство по энзимологии. М.,М ГУ, 1980.7.
Ленинджер А. Основы биохимии. М., Мир, 1985.8. М едведева М.В. М етоды разделения и очистки белков.Учебно-методическое пособие для практических занятий побиохимии, М., Макс Пресс, 2004.9. М едведеваМ.В.М аетН.В.Электрофорезвполиакриламидном геле. Учебно-методическое пособие дляпрактических занятий по биохимии, М., Макс Пресс, 2008.10.Методы практической биохимии (под ред.
Уильямса Б.,Уилсона К.) М., Мир, 1978.Н .О стерм ан Л. А. М етоды исследования белков и нуклеиновыхкислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование. М., Наука,1981.12. Остерман Л. А. Хроматография белков и нуклеиновыхкислот. М., Наука, 1985.13. Остерман Л. А. М етоды исследования белков и нуклеиновыхкислот. М., МЦНМО, 2002.14. Практикум по биохимии (под ред.
Северина С. Е. иСоловьевой Г. А.) М., МГУ, 1989.15.Сафронова М.И., Зайцева Н.Н., Рубцов А.М., ГривенниковаВ.Г., Рыжавская А.С., Гусев Н.Б. Основы практическойбиохимии. Учебно-методическое пособие для практическихзанятий по биохимии, М., Макс Пресс, 2009.16. Скоупс Р. Методы очистки белков. М., Мир, 1985.бб.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
