Методы разделения и очистки белков (1123326), страница 9
Текст из файла (страница 9)
Однако чаще этого достичь не удается. Тогдадля дальнейш его фракционирования и очистки белков можноиспользовать ионообменную хроматографию с элементамиаффинной элюции.Как следует из названия, такой способхроматографии объединяет два подхода: 1) сорбцию разделяемыхкомпонентов(илинекоторыхизних)наносителе засчетэлектростатическихвзаимодействийи2)элюциюинтересующего вещества с помощью специфического лиганда. Так,для элюции с ионообменника необходимого фермента в качествелиганда можно использовать его субстрат и/или кофактор.
При этомфермент элюируется с сорбента, если при данном значении pH45АШ■ААЯ•$•#•9/•••ОООС;ОО*о■ —'АОс оос:©*^•\&А■ш■•••АААфффАО121 - противоионы буфера3А405^ - смесь белков, подвергающ ихся разделению на ионообменнике- градиент соли, элюирующий белки с колонкиРис. 15. Схематическое изображение процесса хроматографии наионообменнике (по [Pharmacia Fine Chemicals]). 1 - Носительуравновеш ен буфером, содерж ащ им противоионы. На сорбентнанесена смесь белков; 2 - обмен противоионов на компонентыразделяемой смеси и их сорбция на носителе; 3 - начало элюциикомпонентов смеси с сорбента буфером с невысокой концентрациейсоли, при которой наблюдается десорбция наименее прочносвязанных белков; 4 - полная десорбция белков при высокойконцентрации соли; 5 - регенерация носителя.лиганд, связываясь с белком, меняет его общий или локальныйзаряд; или если лиганд вызывает конформационные изменения вмолекуле белка, ослабляющ ие ее сорбцию на ионообменнике.Напрактике, когда нужно не просто разделить смесь белков, а, вконечном итоге, получить один (или несколько) высокоочищенныхбелков, часто объединяю т несколько способов элюции белков сионообменника.
Сначала ступенчатой элюцией солью отмываютсорбент от наименее прочно связанных белков. Затем, изменяязначение pH, ослабляют силу электростатического взаимодействия иотмывают колонку от других балластных белков, и на последнемэтапе элюируют интересующий белок с помощью специфическоголиганда (при этом можно одновременно изменить и ионную силуэлюента, и величину pH).46Как бы то ни было, подбор оптимальных условий для очисткибелков с помощью ионообменной хроматографии требует довольнокропотливой работы и не всегда приводит к полному успеху. Впоследнем случае в процесс очистки можно включить другие видыхроматографии или хроматографию на другом ионообменнике.Сорбенты для ионообменной хроматографии.
В настоящеевремяпредложеноогромноеколичестворазличныхионообменников, поэтому перечислить и описать их все в рамкахэтого пособия невозможно. Отметим лиш ь наиболее частоиспользуемые носители.Ионообменники подразделяю т на основании материалов ихматриц и природы их ионогенных групп.В качестве матриц используют целлюлозу, декстран, агарозу(сефарозу), TSK-гели,полиакрилатиполиметакрилат,полистирол, и др.Из-за образования многоточечных контактов носителя сбелком сорбенты на основе полистиролаприменяю т дляфракционирования белков крайне редко (их используют в основномдляразделениянизкомолекулярныхвеществ,например,аминокислот и пептидов).Целлюлоза - полисахарид, образованный остатками глюкозы,соединенными(3-1,4-гликозиднымисвязями.Гидроксильныегруппы придают полимеру высокую гидрофильность и склонность кобразованию многочисленных водородных связей между нитямиполимера.
Кроме того, по этим группам довольно легко осуществитьхимическое присоединение разнообразных групп, в том числе иионогенных. Целлюлоза не устойчива к воздействию сильныхкислот, щелочей и окислителей, а также легко подвергаетсявоздействию микроорганизмов даже на холоду (поэтому ее водныесуспензии хранят в присутствии антисептиков, например, 0,02%азида Na).Дляхроматографиииспользуютволокнистую,микрогранулированнуюисферическуюцеллюлозу.Перваяпредставляет собой относительно длинные нити, получаемые изцеллюлоз древесины или хлопка и «сшитые» водородными связями,а в случае смолы Сервацел (Serva) - диэпоксидами (рис. 16а).Размер волокон варьирует в ш ироких пределах. Колонки,заполненные такой целлюлозой, обеспечиваю т хороший токэлюента, но, как правило, не позволяю т достичь очень хорошегоразделения белков. Их удобно использовать на ранних стадияхочистки.
Для того чтобы повысить жесткость и гомогенностьсорбента и за счет этого увеличить его разреш ающ ую способность,47волокна целлюлозы подвергают частичному кислотному гидролизу.При этом разруш ают аморфные участки целлюлозы, а на их местовводятхимическиесшивки(рис. 166). О бработанная такимобразом целлюлоза представляет собой уже не длинныенити, агранулы продолговатой формы (соотнош ение длины к ширине5:1), однородные по размеру и содержащ ие микрокристаллыцеллюлозы.
М икрогранулированная целлюлоза обладает хорошимиразделяющими свойствами, легко упаковывается в колонку, нообладает большим сопротивлением току элюента. Помимоволокнистойимикрогранулированнойцеллюлозы,дляхроматографии используют такж е сферическую целлюлозу. Этомикрокристаллическая целлюлоза, стабилизированная поперечнымисш ивками, частицы которой имеют форму шариков.абРис.16. Схематичная структура (а) волокнистоймикрогранулированной целлюлозы (по [Остерман, 1985]).и(б)М ногие ионообменники получают на основе декстрина иагарозы, модифицируя носители для гель-хроматографии.
При этомпредел исключения белков для всех ионообменников гораздо выше,чем для исходных матриц, поскольку ионогенные группы,отталкиваясь за счет одноименных зарядов, раздвигают нитиполимера.Очень жесткие и химически стойкие ионообменникивыпускают на основе TSK-гелей.Выбор ионообменника. Выбор ионообменника определяетсясовокупностью факторов:1) зарядом разделяем ы х молекулОчевидно, что кислые белки лучш е делить на анионо-, а щелочные на катионообменнике (табл. 3). Если значение изоэлектрическойточки белка леж ит в области нейтральных значений pH, то, варьируя48Таблица 3.
Выбор ионообменника в зависимости от свойстввыделяемого белка.Тип ионообменникаСуммарный зарядинтересующеймолекулы белкаЗаряд ионогеннойгруппы сорбентаУсловия элюцииКатионообменникА нионообменник+--+0,5-1,5 единиц pHниже р! молекулыбелка0,5-1,5 единиц pHвыше pi молекулыбелкаpH, можно менять суммарный заряд молекул и подбиратьсоответствующий заряду белка ионообменник.2) емкостью сорбентаЕмкость носителя определяет его количест во, необходимое дляразделения всей смеси веществ. Количество сорбента подбираетсяэкспериментально, так как его эффективная емкость зависит отсвойств конкретных фракционируемых молекул.3) ст адией выделения и очисткиНа ранних стадиях выделения, когда анализируемые растворыобладают высокой вязкостью (из-за высокой концентрациианализируемых веществ), а их объемы достаточно велики,предпочтительно использовать ионообменники, обеспечивающ иебыстрое протекание элюента.
Такие носители, как правило,обладают не очень высокой разрешающ ей способностью, нообеспечивают быстрое проведение хроматографии. Именно поэтомуна ранних стадиях выделения используют сорбенты на основеволокнистой, а не микрогранулированной целлюлозы.4) ж ест кост ью и сохранением объема носит еля при измененииp H и ионной силыЭти факторы особенно важно учитывать при разделении веществ,сильно различающ ихся по сродству к обменнику, когда для ихэлюции используется большой диапазон концентрации соли и/илиpH.Подготовкаионообменникакработе.Выбравионообменник, необходимо подготовить его к работе. Для этого,если носитель находится в сухом виде, как и в случае сорбентов длягель-фильтрации, его нужно замочить в 10-15 объемах воды илиисходного буфера и оставить набухать.
Время набухания зависит от49природы ионообменника и от температуры, и варьирует от 2-3 часовдо 2-3 суток. Далее необходимо отделить сорбент от более мелкихчастиц. Последняя стадия бы вает иногда необходима дляионообменников, выпускаемых в виде суспензии.Какправило,ионообменникиподвергаются«преформированию» (что в первую очередь относится к исходносухим сорбентам). Эта стадия преследует, по крайней мере, двецели: 1) за счет отталкивания одноименно заряженных ионогенныхгрупп разорвать «лишние» водородные связи, образовавшиесямежду нитями полимера в процессе высушивания сорбента; и 2)отмыть носитель от соединений, используемых для химическоймодификации матриц.
С этой целью катионообменник переводят вНт-, а анионообменникв О Н'-форму. Однако использованиепротонов и гидроксил-ионов в качестве противоионов часто бываетнецелесообразным, поскольку при их обмене на другие ионыпроисходит существенное изменение pH среды, которое не можетпредотвратить даже буфер. Поэтому, как правило, перед работойионообменники переводят в другую ионную форму, например, N a+или С1', обрабатывая их, соответственно, 0,1-1 М раствором NaOHили НС1.Замена противоиона на более активный противоион (см.выше) происходит сравнительно легко (достаточно промытьсорбент 2-3 объемами соответствующ его раствора).
Если врезультате перевода в другую форму более активный противоиондолжен быть заменен менее активным, промывку следуетосуществлять довольно долго, пропуская через обменник до 30объемов раствора. Особенно трудно перевести из Н+-формы вдругую слабые катионообменники, у которых ионогенной группойявляется остаток плохо диссоциирующ ей уксусной кислоты(например, карбоксиметилцеллю лозу (КМ -целлюлозу)). Для тогочтобы упростить подготовку сорбента к работе, фирмыпроизводители выпускают многие носители (в том числе КМцеллюлозу и КМ -сефадекс) вК а+-форме.
Если для сменыпротивоиона используется только буфер, то можно сначала промытьсорбент буфером с высокой концентрацией (например, 10-кратной),а потом уравновесить колонку буфером с нужной концентрацией.Заполнение колонки. К параметрам ионообменной колонки(по сравнению с гель-фильтрационной) предъявляется меньшетребований. В первую очередь геометрия колонки (соотношениедлины и ширины) определяется типом элюции.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
