Методы разделения и очистки белков (1123326), страница 6
Текст из файла (страница 6)
Чем меньше размер гранул сорбента, тем выше егоразрешающая способность, так как быстрее устанавливаетсяравновесие между подвижной и неподвижной фазами. Однако приэтоммаксимальнодопустимаяскоростьэлюцииниже.Дополнительно ускорить процесс можно, создав перепад давленияна обычных сорбентах до 3-4 атмосфер. Но даже при такомдавлении на мелких гранулах носителя хроматографическийпроцесс будет занимать несколько часов.В зависимости от принципов разделения веществ выделяютнесколько основных типов хроматографии (это деление достаточноусловно).9.2.А дсорбционнаяхроматография.Адсорбционнаяхромат ограф ия - вид хроматографии, где неподвижная фазапредставляет собой твердый сорбент, а подвижная фаза - жидкость(или газ).
Разницу в распределении компонентовсмеси междуподвижнойи неподвижной фазой (сорбентом) обуславливаетразличие в степени их адсорбции, которая определяетсясовокупностью взаимодействий (водородные, вандерваальсовы,29дипольные, ионные и гидрофобные). (Часто хроматографию, впроцессекоторойосновнуюрольиграютгидрофобныевзаимодействия, выделяют в отдельный вид распределительнойхроматографии, хотя порой эти взаимодействия играю т важнуюроль в сложной системе связей при адсорбционной хроматографии).Чем больше сродство вещества к сорбенту, тем медленнее онобудет двигаться вдоль колонки при пропускании через нее элюент а(подвижной фазы).
Для непрочно связанных с сорбентом веществ вкачестве элюента может применяться исходный растворитель. Дляэлюции прочно связанных с сорбентом соединений используютболее (или менее) полярные растворители. Сорбция вещества(веществ) может происходить как на наружной поверхности гранулсорбента (если гранулы не содерж ат пор или имеют поры оченьмалых размеров), так и внутри гранул (если гранулы имеютпористую структуру и эти поры проницаемы для анализируемыхвеществ).
Эффект гель-фильтрации (см. ниже) в случае адсорбцииневелик и им, как правило, можно пренебрегать.Несмотряна то, что сущ ествует много сорбентов,используемых для адсорбционной хроматографии (активированныйуголь, силикагель, окись алюминия и магния и т.д.), широкоприменяется для разделения белков лишь один их них гидроксиапатит (ГАП) (Са5(Р 0 4)з0Н ).
Он сорбирует как кислые,так и щелочные белки, при этом в каждом случае доминирую тразные механизмы взаимодействия биополимера с сорбентом.Хотя хроматографию на гидрофобных сорбентах, при которойадсорбция веществ в основном происходит за счет гидрофобныхвзаимодействий (гидрофобная хромат ограф ия), часто относят квиду распределительной хроматографии, это, по-видимому, невсегда справедливо, поскольку для некоторых гидрофобныхносителей неподвижной фазой является твердое вещество, аподвижной фазой - жидкость.
К таким широко используемымгидрофобным носителям относятся октил- и фенилсефароза, илианалогичные сорбенты на основе силикагеля.Элюцию белков с гидрофобных носителей осуществляют: 1)снижающимся градиентом соли, поскольку при уменьшении ионнойсилы происходит ослабление гидрофобных взаимодействий; 2)высокими концентрациями хаотропных веществ (разрушающихструктуру воды); 3) детергентами.9.3.Распределительнаяхроматография.распределит ельной хромат ограф ии неподвижная и подвижнаяфазы представлены двумя несмешивающимися (или частичносмешивающимися) жидкостями.
Ж идкость неподвижной фазызоПриможет быть иммобилизована внутри пористых гранул (как и пригель-фильтрации (см. ниже)), прочно связана с волокнами гелей(целлюлозой, ПААГ, декстраном и т.п.) или покрывать тонкоймономолекулярной пленкой наружную и внутреннюю поверхностигранул сорбента. Распределение вещ еств между фазами происходитв соответствии с их растворимостями в них.Часто одна из фаз представлена органическим растворителем,в то время как другая является в основном водной. Очевидно, чтофракционирование веществ в этом случае будет происходить постепени их гидрофобности.9.4.Гель-хроматография.Гель-хромат ографияпредполагает особого сродства вещества к неподвижной илиподвижной фазам. Неподвижная фаза представлена жидкостью,находящейся внутри пористых гранул, а подвижная фаза - той жесамой жидкостью, протекающей между ними.Гранулы формируются из гидрофильного полимера, которыйобразует пространственную сетку (рис.
8г). Внутри гранулпостоянно остается жидкость, которая не «увлекается» течениемподвижной фазы.абгвРис. 8. Разделение белков методом гель-хроматографии, а - Наколонку наносят смесь белков различного размера (различноймолекулярной массы); б - крупные молекулы не могут проникнуть вгранулы и первыми элюируются с колонки; в - мелкие молекулыпроникают в гранулы и задерживаются там; г - гранула сорбента вразрезе.31неПереход молекул веществ из подвижной фазы в неподвижнуюи обратно за счет диффузии ничем не затруднен, тогда как внутригранул диффузиязатруднена из-за столкновениймолекулдиффундирующ его вещества с нитями сетки полимера или стенкамипор. В процессе хроматографии крупные молекулы не способныпроникать внутрь гранул и элюируются с колонки с переднимфронтом подвижной фазы - «фронтом элюции».
Коэффициентраспределения К для таких молекул равен нулю. М елкие молекулы,легко диффундирующ ие внутрь гранул, свободно распределяютсямежду подвижной и неподвижной фазами. Значение К для такихмолекул близко к единице, и они элюируются с колонки позднее,чем крупные молекулы (рис. 8). Для молекул средних размеров невесь объем гранул может быть доступен, поэтому они будутперемещаться вдоль колонки с промежуточной скоростью: быстрее,чем мелкие молекулы, но медленнее, чем крупные (0<К<1). Такимобразом, разделение молекул при гель-хроматографии будетпроисходить в зависимости от их размера (рис. 8), поэтому методгель-хроматографии еще называют мет одом молекулярны х сит илигель-фильтрацией.
Хотя часто размеры молекул определяю тся ихмассами, при разделении белков методом гель-хроматографиинужно учитывать также форму их молекул, так как очевидно, чтоглобула будет проникать внутрь гранул иначе, чем вытянутаямолекула.Коэффициентраспределения(К)(см.формулу18)определенной хроматографической зоны при гель-хроматографии (вотсутствие сорбции молекулвеществ) можно представитьотношением объемов подвижной и неподвижной фаз:VsК =где,(20)V0Vs - суммарный объем жидкости неподвижной фазывнутри гранул, доступный для молекул данногоразмераV0 - объем подвижной фазы - свободного объемаколонки вне гранул (рис. 9)Долю внутреннего объема гранул, доступную для молекулданного размера, можно охарактеризоватькоэффициентомдоступности Kj.
Тогда, если V; - полный внутренний объем всехгранул,тоVs= K-V0= K d-V;(21)32Очевидно, что для очень мелких частиц Kd=l и V s=Vj. Вдругих случаях его значения могут лежать в интервале 0<Kd<l.Величина Kd играет важную роль в характеристике процесса гельхроматографии. Ее можно определить для каждой группы молекулопределенного размера, элюируемых с колонки отдельным пиком.Объем элюента, «выш едш его» из колонки к моментупоявления пика вещества (Vr), будет определяться по формуле:V r = V 0+V s= V 0+Kd-V,(22)Следовательно,vr-v0Kd= -------------V,(23)Таким образом, величину Kd легко найти экспериментально.
Дляэтого определяют: Vr - объем элюента от момента нанесенияобразца до достижения максимума пика исследуемого вещества(или, если пик не острый, как объем от начала внесения препаратана колонку до того момента, когда концентрация элюируемоговещества на выходе с колонки достигнет 50% от своегомаксимального значения), V0 - объем элюции очень крупныхмолекул (на практике для определения V0 часто используютокрашенное вещество с молекулярной массой 2 1 06 Д а - «голубойдекстран») и V; - объем элюции очень мелких частиц (например,ионов солей), для которых Kd= l .Однако, поскольку никогда нельзя полностью исключитьвозможность частичной сорбции мелких молекул внутри гранул, напрактике нередко предпочитаю т использовать коэффициент K.av,характеризующий движение хроматографической зоны вдольколонки при гель-фильтрации и определяемой как:vr-v0гдеKav= --------------- .(24)V t-V0Vt - общий (total) объем колонки (рис.
9) (его легкоопределить как объем цилиндра или измерить,заполнив колонку водой).Ф ормула (24) служит определением Kav и ниоткуда не следует.Поскольку (Vt-V0)>V„ величина Kav всегда должна быть меньше илизз.________________равна 1. Если на практике полученная величина Kav> l (т.е. Vr>Vt),это скорее всего свидетельствует о сорбции молекул вещества наносителе. Иногда сорбция обусловлена ионными взаимодействиями,и тогда ее можно избежать, варьируя значение pH буферногораствора и/или увеличивая ионную силу. Если сорбция обусловленагидрофобными взаимодействиями, ионная сила долж на бытьминимальной.V„Vr V0Рис. 9. Наглядная демонстрация параметров (заш трихованная зона)хроматографической колонки при определении величины Kav.Как уже упоминалось выше, для получения пористых гранулиспользуются различные полимерные гели. Среди них наиболееш ирокое применение нашли сефадексы, молселекты, сефакрилы,сефарозы, биогели, улыпрагели, Toyopearl и др.Гель-хроматография широко используется для обессоливаниябелков и смены буфера, например, в качестве подготовительнойстадии для последующих видов хроматографии (ионообменной,аффиннойидр.),дляосвобожденияотрадиоактивныхпредш ественников и детергента (который при концентрациях,превышающ их критическую концентрацию мицеллообразования,существует в водном растворе в виде крупных мицелл, непроникающих в поры геля), для очистки белков от ДНК и другихвысокомолекулярных соединений.Для обессоливания белкового раствора, как правило,используют относительно жесткие мелкопористые матрицы скрупными гранулами,позволяющ ими сущ ественно увеличить34скорость тока раствора через носитель (например, сефадекс G-25или биогель Р-6).
Эти носители можно использовать также длясмены буфера, в котором исходно находится белок, и для отделениямакромолекул от низкомолекулярных соединений.Ввиду относительно низкой (по сравнению с другимихроматографическимиметодами)эффективности,фракционирование белков методом гель-фильтрации используетсядовольно редко, как правило, на заключительных этапах очистки,когда количество компонентов белковой смеси невелико.Для разделения смеси белковых молекул, не сильноразличающ ихся по размеру, и определения их молекулярной массыважно, чтобы величины их молекулярных масс лежали в областиэффективного фракционирования, а значения их Kav - в диапазоне0,2-0,8.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
