Методы разделения и очистки белков (1123326), страница 2
Текст из файла (страница 2)
ЭДТА препятствует связыванию катионовметаллов с белками, а также ингибирует металл-зависимыепротеиназы.Однакоиногда присутствие ЭДТАв среденежелательно, т.к. комплексон может связать функциональноважные ионы металла из активного центра фермента и тем самыминактивировать его.6Таблица 1. Способы разрушения клеток (по [Скоупс, 1985] сизменениями).Способ разрушенияклетокЛизис клеток(осмотический шок)Действие ферментовХимическаясолюбилизация иавтолизГомогенизациявручную (гомогенизатор Поттера),продавливание клетокчерез иглу шприцаНожевой гомогенизатор (гомогенизаторУорринга илиблендер)Растирание с абразивом (песком илиокисью алюминия)Пример тканей иПринцип разрушенияклетокМягкое воздействиеЭритроциты,Осмотическое разрушение клеточнойкультурамембраныэукариотическихклетокОбработкаРазрушениегликопротеиднойбактериальныхоболочки бактерийклеток лизоцимомЭкстракция дрожжей Клеточнаястенка(мембрана)толуоломчастично разрушается под действиемхимических веществ; освободившиесяпри этом литические ферментызавершают процессТкань печени,Клеточная мембрана разрушается прикультурапродавливании ткани через узкийэукариотическихзазоргомогенизатораилииглуклетокшприцаВоздействие средней силыБольшинствоМеханическое разрушение крупныхживотных иклеток и отделение друг от другарастительных тканей мелкихРастительные ткани,Микрошероховатости на частицахбактерии, мышечнаяабразива способствуют разрушениютканьклеток при растиранииСильное воздействиеПресс ФренчаБактерии,Клеткипродавливаютсячерезрастительные клеткималенькие отверстияпод оченьбольшим давлением и разрушаютсяпод действием силы сдвигаШаровая мельницаСуспензии клетокРазрушение клеточной стенки ц поддействиембыстройвибрациистеклянных или стальных шариковУльтразвукСуспензии клетокУльтразвуковые волны создаютвысокий локальный градиентдавления; в результате клеткиразрушаются под действиемнапряжения сдвига и кавитации**К авитация - образован и е в ж идкости при локальном изм енении давлениязаполненны х газом (или паром ) полостей - кавитационны х пузы рьков, которые,захлопы ваясь, генерирую т ударную волну.Для защиты SH-гр у п п белков от окисления в экстрагирующиерастворычастодобавляют(3-меркаптоэтанол(МЭ)7(H S -C H 2-C H 2-O H )илидитиотреитол(ДТТ)(H S -C H 2-C H O H -C H O H -C H 2-S H ) до конечной концентрации 5-20мМ и 0,5-1 мМ, соответственно.
Концентрированный (14 М) РМЭ - тяжелая, сильно пахнущая жидкость. В результате окисленияон быстро превращается в дисульфид. В аэробных условиях и прищелочныхзначенияхpHегоантиоксидантноедействиепродолжается не более 24 часов. Следует помнить, что окисленныйдисульфид МЭ может обмениваться с активными SH -группамибелка, не только препятствуя образованию дисульфидных связей, нои блокируя сульфгидрильную группу с образованием смеш анногодисульфида:СН2-С Н 2-ОНСН2-С Н 2-ОН/ISHSHS|S\I+1/2 0 2 =>СН2-С Н 2-О Н+ Н20+ HS-б е л о кСН2-С Н 2-ОНUHS-CH2-C H 2-OH+НО-СН2-С Н 2- 8 - 8 -б е л о кДитиотреитол - белое порош кообразное вещество без резкогозапаха. При щелочных значениях pH и концентрации Д ТТ в среде0,5-1 мМ его защ итное действие продолжается в течение суток.О бразованныйв результате окисления внутримолекулярныйдисульфид - стабильное соединение, поэтому вероятность реакциитиол-дисульфидного обмена с белком довольно мала.CH2-SHСН2//Н -С-ОН|+ 1/2 02Н О -С -Н\=>||Н О -С -Н\CH2-SH\Н -С-ОН SS/сн2+ н20Частодляпредотвращ енияпротеолизабелковвэкстрагирующийраствор добавляю т ингибиторыпротеиназ(например,ингибиторсериновыхпротеиназфенилметилсульфонилфторид - ФМ СФ (PMSF)).
О днако посколькув клетке много различных протеиназ, отличающихся по механизмудействия, сложно достичь полного ингибирования активности всехпротеолитических ферментов. Поэтому для уменьшения действияпротеиназ чаще просто снижают температуру, выделяя белки нахолоду или помещая белковые растворы в лед.Для хорошей экстракции белков существенную роль играетобъем экстрагирующ ей жидкости. Чем он больше, тем лучшеэкстрагируются растворимые белки, но экстракт будет болееразбавленным. В идеале объем экстрагирующ его раствора долженсоставлять 4-5 объемов исходного измельченного материала.Однако при больш их количествах ткани с таким объемом не всегдаудобно работать в дальнейш ем (например, при центрифугировании),поэтомуприходитсяограничиватьсяменьшимобъемомэкстрагирующ его раствора.
При этом можно несколько разповторять процедуру экстракции.Обломки клеток и клеточные органеллы отделяю т отрастворимой фракции методом центрифугирования (см. ниже), приэтом смесь до центрифугирования называется гомогенат ом, анадосадочнаяжидкость,полученнаяврезультатецентрифугирования, - экстрактом.Разрушение клеточных стенок и мембран приводит квысвобождению содержимого цитозоля.
Приемы, используемые дляэкстрагирования водорастворимых белков, не пригодны длявыделения белков, связанных с мембранами (клеточной, ядерной,митохондриальной и т.п.), а также локализованных внутри органелл(в матриксе митохондрий, эндоплазматическом ретикулуме и т.п.).В этом случае необходимо солюбилизировать белки (извлечь их изнерастворимых структур с помощью детергентов).
Существуетмножество способов солюбилизации белков, но поскольку даннаязадача предполагает работу с растворимыми белками, мы не будемна них останавливаться.5. Центрифугирование.Методыцентрифугированияможноразделитьнапрепаративныеианалитические.Препаративноецент рифугирование используют для выделения и очистки веществиз довольно больш ого количества исходного материала с цельюразделения смеси и дальнейшего изучения свойств составляющих ее9компонентов.
Аналит ическое цент рифугирование применяетсяглавным образом для изучения препаратов макромолекул иличастиц; при этом используют небольш ое количество материала. Спомощью этого метода можно получить данные о чистоте,молекулярной массе и структуре исходного препарата.Ц ентрифугирование основано на разнице в седиментации(осаждении) частиц в гравитационном поле.
Сила, действую щ ая начастицу во время центрифугирования, равна произведению ее«действующей массы» ( т ) на угловое ускорение, котороеиспытывает частица, находящаяся на расстоянии г от оси вращения:F„ = m-co2r ,где со - угловая скорость вращения ротора (рад/сек)®2г - угловое ускорение.(1)«Действующая масса» частицы (с учетом выталкивающейсилы Архимеда) определяется как:m = V(p-pcp) ,(2)где V - объем частицы и равны й ей объ ем ж и д ко сти ,вы талкиваем ы й части ц ей при погруж ени и в растворр - п ло тн о сть частицыр ср - п ло тн о сть ж идкой среды , в которой н аходитсячасти ц а при ц ентр и ф у ги р о ван и и .Д ля частицы сф ер и ч еско й ф орм ы с ради у со м R объем равен:V = 4rcR3/3 = tiD3/6 ,где D - диаметр частицы.(3)Следовательно, центробежная сила, действующ ая на частицу,равна:F„.= 7tD3(p-pcp)a)2r/6(4)Пропорционально увеличению скорости перемещения будетувеличиваться сила трения частицы о жидкость, т. к.FTp = f v ,где F tp - сила трения, действующая на частицуf - коэффициент пропорциональностиv - скорость движения частицы.ю(5)Сила трения, действующ ая на сферическую частицу в вязкойсреде, по закону Стокса составляет:FTp = 6rtRr|cpv = 3n:Dr|CpV ,где rjcp - коэффициент вязкости среды.(6)По достижении частицей определенной скорости сила тренияокажется равной центробежной силе.
Приравнивая центробежнуюсилу (уравнение (4)) и силу трения (уравнение (6)), получим:7tD3(p-pcp)co2r/6 = 3nD r|cpv(7)После достижения равенства двух сил частицапродолжать двигаться с постоянной скоростью, равнойv = D 2(p -p cp)co2r/l 8т|Србудет(8)Поскольку один оборот ротора составляет 2л радиан, угловуюскорость ротора можно выразить как:гдесо = 2я-п/60 ,п - число оборотов ротора в минуту (об/мин)(9)Тогда скорость движения частицы при центрифугированииравна:v = D2(p-pcp)4n2-n2-r/l 8-3600г|ср(10)или:v = D2(p-pcp)n2-n2-r/l 6200г|ср(11)Из формулы (11) следует, что: 1) в центробежном полесферические частицы, имеющие разную плотность и размер,осаждаются с разной скоростью; 2) при одинаковых плотностяхчастицы большего размера оседаю т намного быстрее (d2), чемчастицы меньшего размера; 3) скорость седиментации (оседания)увеличивается с увеличением плотности частиц, поэтому возможнаситуация, когда мелкие, но более плотные частицы, будут оседатьбыстрее, чем крупные; 4) важную роль для эффективногоцентрифугирования играет разность плотностей частицы и раствора.Если для водных растворов с низкой ионной силой она велика, топри высаливании белков (см.
ниже) эта разность становитсянезначительной, что должно быть учтено при центрифугировании;115) чем больше вязкость среды, тем медленнее оседание частиц; 6)скорость седиментации пропорциональна расстоянию частицы отоси вращения ротора (г).Таким образом, поскольку эффективность осаждения зависитне только от скорости вращения ротора, но и от расстояния от осиротора до места расположения анализируемой частицы (обычноуказывают средний радиус ротора), то при описании условийцентрифугирования недостаточно указывать только скоростьвращения ротора (об/мин).Для удобства сравнения условий центрифугирования нароторах с разными радиусами в научной литературе принятопользоваться величиной центробежного ускорения (G), котороеравно:G = со2г = 4 л2-п2-г/3600(12)Центробежное ускорение обычно выражают в единицах g(ускорение свободного падения, равное 980 см/сек2) и называютотносительным центробеж ным ускорением (G*). Относительноецентробежноеускорениеэтобезразмернаявеличина,показывающая во сколько раз центробежное ускорение большеускорения свободного падения:G* = 4тс2-п2-г/(3600-980) = 1 , 1210 s n2 r = G/g(13)Тогда из формулы (11) следует, чтоv = D2(p-pcp)G*-980/l 8г|ср(14)В величину скорости, выраженную в g (14), уже заложенрадиус ротора (вернее, расстояние от оси вращения до серединыцентрифужной пробирки (стакана)), что позволяет не учитыватьразличия в размере роторов, подбирая условия центрифугирования.Существуют номограмма и таблицы, позволяющие определить G* взависимости от скорости вращения ротора и его радиуса.О саждение несферических частиц не подчиняется уравнению(14), поэтому частицы одинаковой массы, но различной формыбудут перемещаться при центрифугировании с разной скоростью.Этот факт используют при исследовании структуры макромолекул спомощью ульт рацент риф угирования, которое позволяет достичьускорения до 700000 g, в отличие от низкоскоростногоцентрифугирования, дающего ускорение более чем на порядокменьше.12Грубые гомогенаты,содержащ ие органеллыилиихфрагменты,можнофракционироватьспомощьюдиф ференциальногоцентрифугирования.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
