Методы разделения и очистки белков (1123326), страница 8
Текст из файла (страница 8)
Эта величина обычноварьирует в диапазоне от 0,05 до 1,7 мэкв/мл, иногда достигая 3,3мэкв/мл (например, для полиакрилата). Для низкомолекулярныхионов величина емкости совпадает с концентрацией ионогенныхгрупп. Для высокомолекулярных соединений (например, белков)40ТАМ, ТЭАЭ, ЧАЕiiт%\а100%ОЭАЭ57S11pH100%-кмбС, СМ, СЭ, СПаРис. 14. Кривые титрования (а) сильных и (б) слабыхионообменников (по [Остерман, 1985]. 100% соответствуетмаксимальному заряду ионита, когда практически все егоионогенные группы ионизированы.
Пунктирные линии указываютграницы, до которых могут раздвигаться области титрования вприсутствии полиэлектролитов, например, белков. Иогенныегруппы: ТАМ - триметиламинометил, ТЭАЭ - триэтиламиноэтил,ЧАЕ - диэтил-2-оксипролиламиноэтил, ДЭАЭ - диэтиламиноэтил, С- сульфо, СМ - сульфометил, СЭ - сульфоэтил, СП - сульфопропил,КМ - карбоксиметил.целесообразнее использовать понятие «эффективной емкости»обменника, которая зависит от соотнош ения размеров молекулбелка, среднего расстояния между ионогенными группами, а такжеот степени доступности всего объема пористой гранулы матрицыдля этих молекул.Сам процесс взаимодействия ионогенных групп сорбента ирастворенных заряженных веществ можно представить следующимобразом.В растворе элюента ионогенные группынесутэлектрическийзаряд.Однакоонине всегда свободныдля взаимодействия, так как экранируются противоионами, которыеприсутствуют в растворе.
В роли противоионов могут выступать нетолько протоны и гидроксилы, но и ионы буфера или соли.Соударяясь с молекулами воды, противоионы отходят отнеподвижных ионогенных групп сорбента, обнажая их заряд, но наих место тут же становятся другие противоионы. Чем вышеконцентрация противоионов, тем меньше времени ионогеннаягруппа будет оставаться свободной. Очевидно, что эффективностьсвязывания противоионов с ионогенными группами зависит отскорости их броуновского движения под ударами молекул41Таблица 2.
Ионогенные группы сильных и слабых катионо- ианионообменников (по [Остерман, 1985], с изменениями).ФормулаНазвание-S 0 3-CH2- S 0 3'-(CH2)2- S 0 3-(CH2)3- S 0 3-P 0 3 -СульфоСульфометилСульфоэтилСульфопропилФосфо--COO'-СН2-СОО‘КарбоксиКарбоксиметил--C H 2- N +(C H 3)ТриметиламинометилТ риэтиламиноэтилДиэтил-2-оксипропиламиноэтил- (четвертичный аминоэтил-)Триметиламиногидроксипропил-Обозначение(англ./русское)С и льн ы е к атионитыS-/CSM-/CMSE-/C 3-sp-/cnР-/Ф-С лабы е к ати он итыС-/КСМ -/КМ-С и льн ы е ан ион и ты-(C H 2) 2- N +(C 2H 5) 3-(CH2)2-N+(C2H 5)2СН2-СН(ОН)-СН,-0 -(C H 2),N +(CH3)3ТАМ -/ТАМ ТЕАЕ-/ТЭАЭQ A E -/4A 3-Q-С лабы е анион и ты-(CH2),-N +H3-(C H ,)2-N+(C2H5)2-((CH2)2-N+H2)n(CH2)2N+H3- c h 2- c 6h 4-n +h 3АминоэтилДиэтиламиноэтилПолиэтиленимин-АЕ-/АЭОЕАЕ-/ДЭАЭРЕ1-/ПЭИ-Парааминобензил-РАВ-/ПАБ-растворителя и от силы кулоновского притяжения, что в своюочередь определяется их физической природой: размерами, формойи величиной заряда.
По своей способности конкурировать с другимиионами за связывание с ионогенными группами противоионыможно расположить в следующ ие ряды:анионы:салицилат>цитрат>Г>Н 8 0 4‘> С 1()з'>Ы 0 з'>Вг'>СЫ >Н 8 0 з’=Вг 01 '> К 0 2 ">СГ>НС0 з>Ю з>Н 2Р04'>НС00'>СНзС 0 0 >СНзСН2С 0 0 >Р'> 0 Н'катионы:Ba2+>Ag+>Pb2+>Hg2+>Cu+>Sr2+>Ca2+>N i2+>Cd2+>Cu2+>Co2+>Zn2+=Cs+>Rb+>Fe2+>M g2+=K+>M n2+>NH4+>Na+>H+>Li+При нанесении разделяемых веществ на ионообменник, онимедленно диффундирую т внутрь гранул полимера (если позволяют42их размеры) или связываются на поверхности носителя.
Дляэлектростатического взаимодействия с ионогенными группаминосителя молекулы разделяемых вещ еств должны: 1) иметь заряд,противоположный заряду ионогенных групп сорбента; 2) подойти кним на такое расстояние, чтобы действие кулоновских сил быловозможно; 3) оба сблизивш ихся иона не должны бытьзаблокированы противоионами.Заряд разделяемых белковых молекул определяется ихаминокислотным составом и величиной pH раствора.
Если белоксодержит много остатков Lys, Arg, His, значение изоэлектрическойточки (pi) такого белка будет лежать в области щ елочных значенийpH, и, наоборот, если в белке много Glu и Asp, значение его pi будетнаходиться в более кислой области pH. Когда pH раствора, вкотором находится белок, больш е pi, больш инство молекул данногобелка будет нести суммарный отрицательный заряд, величинакоторого будет определяться значением pH. Напротив, при pH<plбольшая часть белковых молекул будет заряжена положительно.Следует, однако,помнить,что, несмотряна суммарныйэлектрический заряд молекулы, на ее поверхности есть заряженныегруппы обоих знаков.
Такой локальный заряд (противоположный познаку суммарному заряду белка) также может влиять навзаимодействие белка с сорбентом, если несущие его группыокажутся в непосредственной близости от ионизированных группобменника.Вотличиеотмаленькихпротивоионов,легкодиссоциирующ их от ионогенных групп сорбента, большиемакромолекулы из-за многоточечных взаимодействий трудно«оторвать» от носителя. Разнонаправленные удары молекул воды оповерхность макромолекулы уравновеш иваю т друг друга, что такжеспособствует прочности взаимодействия макромолекул с сорбентом.Однако, в тот момент, когда макромолекула все же удалится отионогенной группы носителя на расстояние, где электростатическиесилы перестанут действовать, ее дальнейш ую судьбу будетопределять концентрация противоионов.
Если она незначительна, товелика вероятность того, что под действием броуновского движениянедалеко отошедшая большая молекула белка вновь сблизится сионогенными группами матрицы и закрепится на ней. Такимобразом, в зависимости от значения pH элю ента и концентрациисолидлякаждогоионообменникаустанавливаетсясвоединамическое равновесие между фиксированными и свободнымиразделяемыми молекулами.43На поверхности белковых молекул, как правило, расположеномного заряженных групп. Если расстояние между ними сравнимо срасстояниеммеждуионогеннымигруппаминосителя, товзаимодействие белка с сорбентом может обеспечиваться не одним,а несколькими кулоновскими взаимодействиями, что существенноусиливает связь белка с носителем. Это обусловлено тем, чтоотносительнаянезависимостькулоновскихвзаимодействийспособствует сохранению одной связи при разрыве другой, и, такимобразом, удержанию молекулы вблизи сорбента.
Такие прочныемноготочечные контакты удается разорвать лишь под действиемочень высокой концентрации соли, что может вызыватьденатурацию белков и не способствует разделению белковой смеси.Следовательно, при фракционировании смеси белков лучшеизбегать их многоточечных контактов с сорбентом. Для этогоцелесообразно использовать ионообменники небольшой емкости,при необходимости изменить степень ионизации носителя, выбравдругое значение pH, или уравновесить сорбент противоионами втакой концентрации, которая бы препятствовала многоточечнойсорбции.Таким образом, эффективность разделения смеси белков наионообменнике будет определяться:1) Физико-химическими свойствами сорбента (природойионообменных групп, «силой» ионообменника, его емкостью (илиэффективной емкостью)) и компонентов смеси (pi, локализациейзаряженных аминокислотных остатков и т.п.).2) Величиной p H элюента, которая определяет степеньионизации как ионогенных групп носителя (особенно этосвойственно «слабым» ионообменникам), так и белков смеси, что всвою очередь влияет на силу электростатических взаимодействийпротивоположно заряженных ионов.
Очевидно, что в зависимостиот аминокислотного состава знак и величина суммарного зарядаразделяемых белков при одном и том же значении pH могутсущественно различаться. Следовательно, варьируя значения pH,можно не только менять характер и силу взаимодействия вещества сионообменником, но и соотнош ение этих сил для различныхкомпонентов разделяемой смеси. Как правило, при ионообменнойхроматографии смесь разделяемых белков наносят на колонку в томже самом буфере, которым сорбент уравновешен. При этом белки недолжны в нем денатурировать, а ферменты инактивироваться.Оптимальная для разделения компонентов смеси величина pHэлюента подбирается, как правило, экспериментально.3) Концентрацией соли (ионной силой) в элюенте. Даже при44оптимальном значении pH сорбция и разделение веществ наионообменникебудутсильнозависетьотконцентрациипротивоионов, в роли которых выступают ионы диссоциируемойсоли. Так, при их малой концентрации белок настолько прочноможет связаться с сорбентом, что практически не будетпродвигаться (элюироваться) по колонке под действием токаэлюента.
Напротив, если концентрация соли (а, следовательно,противоионов) слишком велика, разделяемые белки вообще небудут сорбироваться на носителе и, не разделивш ись, будутэлюироваться с колонки в свободном объеме. При промежуточныхконцентрациях соли и при определенном значении pH для каждогобелка будет иметь место равновесие между сорбцией и десорбцией,когда часть молекул будет находиться в подвижной фазе, а другаячастьбудетсвязаннойсионообменником.Увеличиваяконцентрацию соли, можно поочередно элю ировать с колонкибелки, обеспечивая их разделение (рис. 15). Концентрацию солиможно увеличивать непрерывно, создавая на колонке линейный (илинелинейный) градиент.
Часто используют и так называемуюступенчатую элюцию. В этом случае сначала растворами с низкойконцентрацией соли (низкой ионной силой) элю ирую т белки, слабосвязанные с носителем, а затем использую т растворы с болеевысокой концентрацией соли и элюирую т белки, более прочносвязанные с сорбентом. Оба типа элюции имеют свои достоинства инедостатки.Такступенчатаяэлюцияболеепростаивоспроизводима, в то время как непрерывная элюция градиентомсоли обеспечивает более эффективное разделение компонентовсмеси. Целесообразностьприменения тогоили иного видаэлюции определяется конкретнымицелямиэкспериментаисвойствами разделяемых компонентов.Варьируя pH буфера и концентрацию соли, иногда можноподобрать условия для полного разделения белков смеси в ходеодной хроматографии.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
