Методы разделения и очистки белков (1123326), страница 7
Текст из файла (страница 7)
Если предъявляемым требованиям отвечаю т несколькоматриц, то предпочтительнее выбрать ту из них, для которойинтервал Kav леж ит ближе к пределу исключения (предел эксклюзии)белков(область малых значений Kav). В этомслучаефракционирование займет меньш е времени, а разделение будетлучше.
Наиболее подходящими для фракционирования белковявляются сефадексы G-75+200, биогели Р 60^-200, ультрагели серииАсА 34-ь54 и т.д. При этом предпочтительно выбирать матрицы снаименьшимразмеромгранул,поскольку такие носителиобеспечивают более качественное разделение.
Однако скорость токараствора через колонку с такими носителями меньше, чем длясорбентов с более крупными гранулами.При выборе носителя следует также учитывать возможностьсорбции белков на материале матрицы.Определение молекулярной массы белка. Часто гельфильтрация применяется для определения молекулярной массыбиополимеров, особенно белков. Для этого на практике с помощьюнабора белковизвестноймолекулярноймассыстрояткалибровочный график зависимости Kav от десятичного логарифмаих молекулярной массы (М) (который, как правило, линеен дляглобулярных белков), по которому определяю т молекулярную массуисследуемого белка (рис.
10). Однако такой подход довольноприблизителен и годится лишь для глобулярных белков одинаковойплотности.П редел исклю чения предельнаяпроникаю щ ая в поры геля.м олекулярная35м ассачастицы,ещ е0.0-1----------1----------,----------,----------,1.001.251.501.752.00lgMРис.
10. Зависимость Kav от десятичного логарифмамолекулярной массы белка (кДа). (Калибровочный график дляопределения молекулярной массы белка).9.5.Аффинная хроматография. Аффинная хроматографияявляется частным случаем адсорбционной хроматографии. Этовысокоизбирательныйивысокоэффективныйметодфракционирования,основанныйнабиоспецифическомвзаимодействии между молекулами, обладающ ими высокимсродством друг к другу (ферментом и его субстратом, кофакторомили ингибитором; антигеном и антителом; гормоном и рецептором,и т.п.) Этот метод позволяет за одну стадию достигать оченьвысоких степеней очистки (до нескольких тысяч раз).Если один из компонентов такой пары прочно закрепить наматрице в качестве лиганда, то с его помощью можно извлечь изсмеси соединение (или несколько соединений), обладающееособенно высоким сродством к такому лиганду (рис.
11).Примесные молекулы удаляю т промыванием сорбента, послечего элюируют нужное вещество, ослабляя его взаимодействие слигандом, варьируя условия элюции или вытесняя его с сорбента,добавляя в элюирующий раствор вещества-конкуренты. Ослаблениесвязывания вещества с лигандом достигается изменением pH,увеличением ионной силы и температуры элюента, введением в егосостав органических растворителей, детергентов, хаотропных иденатурирующ их агентов.Иногда из-за высокой прочности комплекса для десорбциивещества с носителем требуются очень жесткие условия, что можетпривести к необратимой денатурации очищ аемого вещества. Этогоможно избежать, добавляя в элю ент такой же лиганд, которыйнаходится в иммобилизованном состоянии на колонке, или другойлиганд,конкурентновзаимодействующ ийсвеществом,36+ НЕ С В Я З А В Ш И ЕСЯ БЕЛКИгРис. 11.
Принцип аффинной хроматографии (по [Pharmacia FineChemicals]), а - Взаимодействие лиганда (L) с комплементарноймолекулой; б - иммобилизация лиганда на матрице; в взаимодействие иммобилизованного лиганда с комплементарноймолекулой (S); г - десорбция комплементарной молекулы сносителя (см. объяснения в тексте).сорбированным на носителе. За счет специфической конкуренции«приш итого» и растворенного лигандов очищ аемое веществоотделяется от матрицы и элюируется с колонки в виде комплекса срастворенным лигандом, после чего при необходимости уже врастворе этот комплекс разрушают. Элюцию также часто проводятраствором другого вещества, конкурирующ его с очищаемымвеществом за лиганд, связанный с матрицей.Лиганды можно подразделить на две группы: лиганды синдивидуальной и групповой специфичностью .
К первой группеотносятся вещества, обладающ ие высокой специфичностью ивзаимодействующие только с одним классом соединений. Такиевзаимодействия характерны для пар антиген-антитело, ферментсубстрат, гормон-рецептор и т.д. Ко второй группе можно отнестилиганды,способныевзаимодействоватьсцелойгруппой37«родственных» соединений. Такие взаимодействия характерны,например, для никотинамидадениндинуклеотида и различныхдегидрогеназ, или для ионов никеля и кобальта, иммобилизованныхна носителе и взаимодействующ их с полигистидиновымиповторами, искусственно встроенными в полипептидные цепинекоторых рекомбинантных белков. В качестве лиганда не следуетиспользовать вещества с ярко выраженными гидрофобнымисвойствами или богатые ионогенными группами, так как в обоихслучаях будет трудно избежать неспецифической сорбциипримесей.Хотя принцип аффинной хроматографии очень прост, этоодин из самых тонких и капризных методов.
При конструированииаффинного сорбента могут возникнуть существенные сложности,поскольку: 1) нужно правильно выбрать носитель; 2) определеннымобразом закрепить на нем нужный лиганд и 3) правильно подобрать«спейсер» - «ножку» (чаще всего это алифатическая цепочка из 6-8метиленовых остатков), которая позволяет избежать стерическихпрепятствий при присоединении макромолекул белка к носителю(рис. 12).Рис. 12. Роль «спейсера» при аффинном взаимодействии (см.объяснения в тексте): а - лиганд закреплен непосредственно наматрице; б - лиганд закреплен на матрице через «спейсер».В качестве матриц для аффинной хроматографии чаще всегоиспользуют гель обычной или сшитой агарозы (сефарозы) илисмешанные гели типа «Ultragel».
Помимо общ их для всеххроматографических матриц требований, эти гели характеризуютсяобязательнымналичиемсвободныхгидроксильныхгрупп,позволяющих с помощью несложных химических реакций связать сматрицей лиганд или «спейсер».38Чтобы избежать денатурации лиганда в процессе посадки наматрицу и в целом упростить эту процедуру, матрицупредварительно активируют.Дляэтого ееобрабатываютхимическими соединениями: бромцианом, глутаровым альдегидом,1,4-бутандиолдиглицидиловым эфиром, перйодатом натрия и др.Далее на активированную матрицу при необходимости«сажают» спейсер. В качестве «спейсеров» часто используют либо1,6-диаминогексан (H2N -(C H 2)6-N H 2), либо 6-аминокапроновуюкислоту (H2N -(C H 2) 5 -С О О Н ).
П рисоединение лиганда на аминоили карбоксильной группе «спейсера» также требует специальнойактивации последнего.Часто для работы используют фирменные матрицы с уже«пришитыми» спейсерамии лигандами. Их номенклатуранепрерывно расширяется. Тем не менее, иногда бывает необходимосконструировать аффинный сорбент для решения конкретнойзадачи самостоятельно.9.6.Ионообменная хроматография. Еще одним частнымслучаем адсорбционной хроматографии является ионообменнаяхромат ограф ия.
Само название указывает на то, что связь молекулвещ ества с сорбентом долж на быть ионной, т.е. определятьсякулоновскимисиламипритяжениямеждупротивоположнозаряженными ионами. Неподвижная фаза в случае ионообменнойхроматографиипредставленапористымигидрофильнымигранулами, образованныминитями полимеров,к которымковалентно «пришиты» ионогенные группы, уравновешенныепротивоионами,диссоциирую щ имивводномраствореиспособными замещаться другими противоионами. Подвижнойфазой является водный раствор (элюент), где в ионизированномвиде присутствует смесь веществ, которые необходимо разделить.Распределение компонентов смеси между подвижной инеподвижной фазами будет зависеть от сил электростатическоговзаимодействия ионов или заряженных групп в молекулахразделяемых веществ с заряженными группами ионообменника.
Этовзаимодействие определяется как природой самого вещества (илиионообменника), так и свойствами жидкой среды, в которой онопроисходит(pH,ионнойсилойраствора(содержаниемпротивоионов)).Все ионообменники прежде всего следует разделить накатионо- и анионообменники (катиониты и аниониты) (рис. 13). Вкатионообменниках ионогенные группы (подобно катоду) заряженыотрицательно и связывают из подвижной фазы положительнозаряженные катионы. В анионообменниках ионогенные группы39(подобно аноду) заряжены положительно и связывают из раствораотрицательно заряженные анионы.©©анион ообм ен н иккати он ообм ен н икРис.
13. Схематическое изображение катионо- и анионообменника.И катионообменники, и анионообменники можно условноразделить на «сильные» и «слабые».Различия между ниминаглядно иллюстрируют кривые титрования их ионогенных групп(рис. 14). К «сильным» ионообменникам относятся сорбенты,полностью ионизированные (т.е. сохраняю щ ие свой заряд) во всемдиапазонеpH,прикоторомпроводятфракционированиебиологическихмолекул(рН=3-11) (рис. 14а). «Слабыми»называют такие ионообменники, которые ионизированы вограниченной области значений pH. Степень ионизации ионогенныхгрупп слабых ионитов снижается постепенно (рис.
146), и ихионизацией можно управлять путем изменения pH элюента. Такимобразом, в случае «слабого» ионита меньше не только рабочийдиапазон pH, но и прочность сорбции вещества на определенныхучастках этого диапазона.Ионогенные группы сильных и слабых ионитов, наиболееширокоиспользуемыевионообменнойхроматографии,представлены в таблице 2.Важной характеристикой лю бого ионообменника является егоемкость - величина, отражающ ая максимальное количество ионов,которое может с ним связаться при значении pH, соответствующемего100%-нойионизации.Емкостьвыражаетсячисломмиллиэквивалентов на 1 г сухого обменника (мэкв/г) или на 1 млнабухшего в растворе обменника (мэкв/мл).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
