Методы разделения и очистки белков (1123326), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Приэтомсначалапроводят короткое центрифугирование на низких скоростях. В этихусловиях осаждаются только самые большие и тяжелые частицы.Полученныйсупернатантподвергаю т болеедлительномуцентрифугированию на более высоких скоростях и собираютчастицы среднего размера. Супернатант подвергают еще болеедлительному центрифугированию на очень больших скоростях исобираю тнаиболеемелкиеилегкиечастицы.Такоедифференциальное центрифугирование является обычно первымэтапом очистки клеточных органелл. Основные компоненты клеткиосаждаются в следующей последовательности: целые клетки и ихфрагменты - ядра - хлоропласта - митохондрии - лизосомы (илидругие микротельца) - микросомы (фрагменты гладкого ишероховатого эндоплазматического ретикулума) - рибосомы.П ередцентрифугированиемцентрифужныестаканы(пробирки), стоящие в роторе друг напротив друга, должны бытьуравновешены. При этом не следует уравновешивать очень плотныерастворы водой.На первых стадиях выделения после центрифугированиясупернатант обычно фильтруют через фильтровальную бумагу иличерез 4 слоя прокипяченной в ЭДТА марли (что существенноускоряет фильтрацию).
Это позволяет удалить не осевш ие врезультате центрифугирования и флотировавш ие (всплывшие) наповерхность супернатанта липиды.6. Методы фракционирования белков.Д альнейш ее разделение и очистка растворимых белковосновывается на различиях в их физико-химических свойствах:растворимости,термостабильности,гидрофильностии/илигидрофобности, размере молекул и т.д. Существуют относительно«грубые» и более «тонкие» методы фракционирования белков. Кпервым, главным образом, относятся: т епловая обработка,изоэлект рическоеосаж дение,осаж дениеорганическимираст ворит елям и и высаливание.6.1.Тепловая обработка. Все белки можно условноразделитьнадвебольш иегруппы:термостабильныеитермолабильные.
Термостабильные белки выдерживают нагреваниепорой до 90-100°С, в то время как уже небольшое нагреваниетермолабильных белков вызывает изменение их конформации, а при50-60°С больш инство из них необратимо денатурирует. Таким13образом,нагреваябелковыйраствор,можноотделитьтермостабильные белки, которые будут оставаться в растворимойфракции, от термолабильных белков, которые быстро денатурирую ти выпадают в осадок, легко отделяемый центрифугированием.Очевидно, что термообработку имеет смысл использовать дляочистки термостабильных белков. О днако следует помнить, чтообразующиеся при нагревании агрегаты термолабильных белковмогут захватывать часть термостабильных белков в осадок. Поэтомуследует тщательно и заранее подбирать время и температурныйрежим прогрева белкового раствора. Обычно эта процедураосуществляется в микроволновой печи или на водяной бане.
Приэтом водяная баня, как правило, нагревается до более высокойтемпературы, чем требуется для обработки белкового раствора,чтобы сократить время операции. Это важно, поскольку принагревании активируются многие протеиназы, которые стабильныдаже при высоких температурах. В связи с этим после короткого повремени нагревания должно следовать быстрое охлаждениераствора (при перемешивании во льду). Термообработка должнаосуществляться при постоянном перемешивании и контролетемпературы в нагреваемом растворе, так как превышениетемпературы даж е на несколько градусов может привести кнеобратимой денатурации выделяемого белка.6.2.Изоэлектрическое осаждение.
Для лю бого белкасуществует оптимальная величина pH, при которой он имеетстабильную структуру и физиологическую активность. Длябольшинства белков (но далеко не для всех) это нейтральныезначения pH (~7,0). При изменении pH в кислую или щелочнуюобласти может происходить денатурация белков (обратимая илинеобратимая), так как в этих условиях участки белковой молекулылибо приобретают большое количество зарядов одного знака, чтоприводит к отталкиванию между ними и разворачиванию белковойглобулы, либо теряю т заряды, стабилизирую щ ие структуру белка(рис.
2).Больш инство белков обладает наименьшей растворимостьюпри значениях pH, близких к их изоэлект рической т очке (значениеpH, при котором суммарный заряд молекулы равен нулю). В этомслучае электростатическое отталкивание между молекулами белказначительно ослабевает, что увеличивает вероятность агрегации ивыпадения белка в осадок (рис. 3).Изменение pH белкового раствора следует осущ ествлять, повозможности не используя концентрированных кислот и щелочей(для того чтобы избежать сильного локального закисления или14защелачивания, и последующей денатурации белков). Дляизоэлектрического осаждения лучш е всего применять уксуснуюкислоту, карбонат натрия или концентрированный раствор трис (3гидроксиметиламинометан - (HOH2C)3- C - N H 3 +) и вносить их покаплям при постоянном перемешивании.В нут рим олекулярноеНОэлект рост ат ическоеп рит яж ениеа)вРис.
2. Схема денатурации молекулы белка при изменении pHсреды, а - Электростатические силы, действующ ие внутри белковоймолекулы и стабилизирующ ие ее; б - частичная денатурация белка,вызванная закислением среды; в - полная денатурация белковоймолекулы (по [Скоупс, 1985] с изменениями). (Объяснения см. втексте).Протонирование и депротонирование заряженных групппроисходит практически мгновенно, в то время как для достижениямаксимальной агрегации белковых молекул требуется время.Поэтому после доведения pH до нужного значения, близкого к piвыделяемогобелка, растворинкубируют 20-30 мин приперемеш ивании и лиш ь после этого центрифугируют.15РастворимостьОбразованиеагрегатовРис. 3.
Растворимость белка при изоэлектрическом осаждении (по[Скоупс, 1985]). (Объяснения см. в тексте).6.3. Осаждение белков органическими растворителями. Вводных растворах сильно поляризованные молекулы водыпредставляют собой диполи (рис. 4а), упорядоченным образомрасположенные вокруг молекул белка. Они экранирую т заряд белка,создавая гидратную оболочку, и препятствуют электростатическомувзаимодействиюучастковбелковыхмолекул,несущихпротивоположные заряды.Добавление к водному белковому раствору органическихрастворителей (ацетона, этанола, метанола, изопропанола, диоксанаи т.п.) приводит к снижению диэлектрической проницаемостисреды.Врезультатеэтогомолекулыбелказасчетэлектростатических сил начинают взаимодействовать друг с другом,образуя агрегаты (рис. 4в).
Крупные молекулы агрегирую т быстрее,чем мелкие, так как больше вероятность нахождения на ихповерхности заряженного участка, комплементарного участкудругого белка.Различную чувствительность к действию органическихрастворителей используют для фракционирования белков. Одним изглавныхпреимуществэтогометодаявляетсято,чтофракционированиеможнопроводитьприотрицательнойтемпературе, так как все смеси органических растворителей с водойзамерзают при температуре ниже 0°С.
Это особенно важно,поскольку при температуре более +10°С органические растворители16н»+а\Ч- гидроф обны й участок белка\. молекула органического растворителявРис. 4. а - Поляризация молекулы воды; б - гидратацияоднозарядныхкатионовианионоввводномрастворе[http://him .lseptem ber.ru/2005/22/18-l.jpg]; в - образование агрегатовмолекул белка в присутствии органического растворителя (по[Скоупс, 1985] с изменениями).начинают проникать во внутренние части белковой глобулы идестабилизироватьее,связываясьсгидрофобнымиаминокислотными остатками, тем самым оказывая денатурирующеедействиенабелок.Существеннымпреимуществомфракционированияпри помощи органических растворителейявляется тот факт, что многие из них (например, ацетон и многиеспирты) летучи и их можно легко удалить из осадка белкалиофилизацией.6.4.
О саждение белков высокими концентрациями солей.Большинство растворимых белков не образуют агрегатов при17физиологической ионной силе (концентрации солей в растворе 0,150,2 М) и нейтральных значениях pH, тогда как многие из них плохорастворимы в дистиллированной воде. Увеличение растворимостибелков при добавлении соли называют эффектом всаливания.По мере снижения концентрации соли (например, приобессоливании) уменьшается концентрация низкомолекулярныхионов в растворе. Вследствие этого растворимость белков падает,поскольку противоположно заряженные участки белковых молекул,неэкранируемыебольшеионамисолей,начинаютвзаимодействоватьдруг с другом.
Образующиеся при этомагрегаты можно удалить центрифугированием и, таким образом,очистить нужный белок, если он остался в растворе.Однако чаще для фракционирования сложных белковыхсмесей используют эффект высаливания, состоящ ий в агрегациибелков в присутствии высоких концентраций некоторых солей.Добавление соли сопровождается локальными изменениями втонком слое молекул воды, покрывающих поверхность молекулыбелка. При этом нарушается его гидратная оболочка. Гидрофобныеучастки, ранее экранированные упорядоченно расположеннымимолекулами воды, оказываются экспонированными и начинаютвзаимодействовать между собой. Чем больше таких гидрофобныхучастков на поверхности белка, тем больше вероятность агрегации,которая становится возможной уже при сравнительно низкихконцентрациях соли.
В то же время белки, содержащиенезначительное количество гидрофобных участков, остаются врастворе даже при очень высоких концентрациях соли.Несмотря на то, что при высаливании исходной смеси иногдапроисходит выпадение в осадок соосаждаю щ ихся белков, многиебелки осаждаются в узкой области концентраций соли, что делаетэту процедуру высокоэффективным методом фракционирования.На высаливание белков влияет величина pH раствора и еготемпература. Если значение pH раствора близко к изоэлектрическойточке выделяемого белка, то его осаждение под действием солибудет более эффективным, так как отсутствие суммарного зарядатакже способствует агрегации белка. Как это ни покажется напервый взгляд странным, но при уменьшении температурыбелкового раствора растворимость белков будет увеличиваться.Этотэффектобъясняетсяослаблениемгидрофобныхвзаимодействий с понижением температуры.Эффективностьвысаливанияв значительнойстепениопределяется выбором соли.
Хотя ни одна соль не осаждает белокполностью, а лишь снижает степень его растворимости, наиболее18эффективны соли, анионы которых имеют наибольш ий удельныйзаряд (т.е. заряд на единицу поверхности). К таким анионамотносятся, например, сульфат, фосфат и цитрат. По способности квысаливанию анионы располагаются в ряд Гофмейстера: SCN'-сГ<С104"<М0з‘<Вг'<СГ<СНзС00‘< 8 0 42‘< Р 0 43'. Однако, поскольку принейтральных значениях pH фосфат представляет собой смесь ионовН Р 0 42' и Н2Р 0 4', которые менее эффективны, чем Р 0 43‘, на практикесульфат оказывается наиболее подходящим анионом. Размеркатиона не имеет столь существенного значения для высаливания.Тем не менее, одновалентные катионы по эффективностирасполагаются в следующем ряду: N H 4+>K+>Na+>Li+.Важное значение для высаливания имеет не только хорошаярастворимостьиспользуемойсоли,ноиплотностьконцентрированного раствора, так как эффективность отделенияосадка при центрифугировании определяется разностью междуплотностью белковых агрегатов и плотностью растворителя (см.выше).
Еще одним важным фактором, влияющим на выбор соли,является отсутствие сущ ественного экзотермического эффекта,сопровождающ его растворение соли в воде. Очевидно, что соли,растворимость которых сопровождается значительным выделениемтепла, неприемлемы для фракционирования белков.Всем перечисленным выше требованиям отвечает сульфатаммония. Во-первых, эта соль хорошо растворима в воде(концентрациянасыщенногорастворавводесоставляетприблизительно 4 М).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
