Osnovy_biokhimii_Nelson_i_Kokh_tom_1 (1123313), страница 97
Текст из файла (страница 97)
245 1 !36 ! 146 [ 149 1 168 .— —, $ !82 '- — --— Э 1914! =,—,, —,: ПепьС л 1. 8 220 - — -- — -* 6.4 Примеры ферментатявных реакций [301[ состояния, а также является классическим примером общего кислотно-основного и ковалснтного катализа.
Химотрипсин ускоряет гилролиз пептидной связи как минимум в 10» рщ!. Он не катализирует прямую атаку пептилной связи молекулой воды, а участвуст л образовании переходного ацилфсрмснтного комплекса. Данная реакция имеет две четко различимые стадии. На стадии ацилирования происходит расщепление пептилной связи и образование сложнозфириой связи между карбопильной группой пептила и ферментом. На стадии дсацилиронания происходит гилролиз сложнозфирной связи и высвобожденис исходной формы фермента. 1302] Часть!. 6.
Ферменты Наличие ковалснтного ацилфсрментного производного было продемонстрировано методами нредстационарной кинетики. Химотринсин гидролизует не только нептиды, но и нсболыиие молекулы сложных эфиров и амидов. Данные реакции протекают гораздо медленнее, чем гидролиз пептидов, поскольку энергия связывания с небольшими субстратами гораздо ниже; в результате такие реакции легче изучать. В 1954 г.
Б. С. Хартли и Б. А. Килби обнаружили, что скорость гидролиза и-нитрофснилацстата нод действием химотринсина, определявшаяся но образованию и-нитрофснола, сначала была очень высокой, а потом снижалась (рис. 6-!9). Проведя экстраноляцик1 к нулевому моменту времени, В 3,0. я о В 2.0 в Б Я 1,0 0 Й 0 Время (мнн) О 3 Оя1Ч ' Π— С вЂ” СНл Оян ' ОН и-Нитрофснил- и-Ннтрофсннл ацстат б стро О ь Фсрмснт — ОН Фермент — Π— С вЂ” СНл мкмснля О НО Уксусная кислота Рнс. 6-19. Применение предсхацнонарной кинетики для доказательства образования ацнлферментного производного. За гидролизом и-нитрофеннлацетата следили по обраэованнго окрашенного продукта и-ннтрофенола. В начале скорость образованна и-ннтрофенола находится почти в стехиометрическом соответствии с количеством фермента — это быстрая стадия ацнлнровання.
Затем скороеп снижается, поскольку высвобождение фермента лимитирует медленная реакция деацнлнровання. они заключили, что быстрая фаза соответствует ситуации, цри которой на каждую молекулу фсрмента приходится образование одной молекулы и-нитрофенола. Хартли и Кнлби предположили, что в данной реакции происходит быстрое ацилирование всего имеющегося фермента (и высвобождение и-нитрофснола) с нослсдукхщим медленным его деацилированием.
Аналогичные результаты были получены для многих других ферментов. Возможность обнаружения быстрой стадии реакции является еще одним примером использования кинетических методов для идентификации реакционных стадий. Дополнительные данные о механизме действия химотрипсина были получены при анализе влияния рН на скорость реакции. Зависимость скорости гидролитического расщепления субстратов нод действием химотрипсина от рН обычно имеет колоколообразный вид (рис. 6-20). Скорости реакции на рис. 6-20, а были определены при низкой (ненасышающей) концентрации субстрата и, следовательно, отражают отношение Й,м / Км.
Данный 1рафик можно разделить на составляющие части. Для этого следует определить максимальную скорость при каждом значении рН и изобразить зависимость (1,ы от рН (рис. 6-20, 6). После определения Км для каждого значения рН можно также построить график зависимости 1/Км от рН (рис. 6-20, в). Анализ данных кинетики и структуры показал, что изменение я,м связано с состоянием ионизации Н)э~т. Снижение величины я„„цри уменьшении рН происходит из-за протонирования остатка Н)э"', который более не способен забирать протон от 5ег'з" на первой стадии реакции (рис.
6-21). Такое снижение скорости указывает на важную роль общего основного и обсцсго кислотного катализа в механизме действия химотринсина. Изменения параметра 1/Км отражают ионизацию а-аминогруппы остатка 11е'", расположенного на Х-конце одной из трех цолицентидных цепей химотрипсипа. Эта группа участвует в образовании солевого мостика с Аэршл, что стабилизирует активную конформацию фермента. Когла нри повышении рН эта 1рунна теряет протон, солевой мостик распадается, и происходящие конформационные изменения закрывают гидрофобный карман, куда помещается боковая цепь ароматического аминокислотного остатка субстрата (рис. 6-18).
В результате субстрат не может полноценно связы- б.4 Примеры фермектагивных реакций 1303) 6 7 8 9 10 рН 6 7 8 9 1О ры 6 7 8 9 10 рН Рис. 6-20. Зависимость активности химотрипсииа от рй. а) Зависимость скорости гидролитического расщепления субстратов под действием химотрипсина от рН имеет колоколообразный вид с максимумом при рН 8,0. Скорость г была рассчитана при низкой концентрации субстрата к поэтому отражает отношение 1с,/Кк. С помощью нинеткческих методов можно определить раздельно значения 1с~ и К„и построить график зависимости каждого из этих параметров от рН (б и в). Из этих графиков видно, что переход при РН и 7 связан с изменением 1с „а при рН .
8,5— с изменением К„. Результаты кинетических и структурных исследований показали, что эти переходы отражают измекеккя состояния ионизацим соответственно боковой цепи ВЬн (при отсутствии связывания субстрата) и о-аминогруппы Пеи (на Н-конце цепи В).
Для оптимальной активности фермента Н1зз' должен находиться в непротонировинном состоянии, а Пем должен быть протонирован. ватъся, что выражается в увеличении константы Михазлпса. Нуклеофилом на стадии ацилирования выступает кислород остатка Яег'ээ. (Протеазы, в каталитическом механизме действия которых принимает участие остаток Бег, называкэт ссриповыми протеазами.) Значение рК,. гидроксильной группы Ясг обычно слишком нысокое, чтобы нспротонированная форма могла встречаться в значительной концентрации при физиологических значениях рН. Однако в молекуле химотрипсина Ясгсзэ связан водородными связями с Нш"'~ и Азр'"'" в так называемую катвлитическую триаду. Прн связывании пептидного субстрата с химотрипсином происхолит небольшое изменение конформации белка, укорачивающее водородную связь между Нсзэт и Азршз, что приводит к более сильному взаимодействию (сильная водоролная связь). Это в свою очередь повышает рК, Нсзэт от -7 (в свободном гистидине) ло >12, что позволяет гистидину действовать в качестве более сильного обсцего основания и удалять протон из гидроксильной группы Нсгсзэ.
Удаление протона предотвращает образование очень неустойчивого положителыюго заряда па гилроксильпой группе Нет'зэ и делает боковую цепь Бег сильным нуклеофилом. На более поздних стадиях реакции Нигэт выступает в качестве донора протона и протонирует амипогруппу в ухоляшей группе (в улалясмой части субстрата). При атаке карбопильной группы субстрата кислородом остатка Бегсзэ образуется коротко- живущее четвертичное промежуточпос соединение, в котором карбонильный кислород имеет отрицательный заряд (рис. 6-2)). Этот зарял, локализованный в карманс молекулы фермента, называемом оксианионовой дырой, стабилизируется водоролными связями с участием амидных групп двух пептидпых снязсй в молекуле хпмотрипсина.
Одна из этих водородных связей (с участием Иу'эз) присутствует только в ланном промежуточном соединении, а также в переходных состояниях при его образовании и распаде; она снижает уровень энергии, необходимый для достижения данных состояний. Это один из примеров, иллюстрирующих роль энергии связывания в катализе. Значение комплементарности фермента переходному состоянию для осуществления ферментативного катализа обсуждается в лоп. 6-3. [304~ Часть !.
б. Ферменты Хнмотрнпенн (свободный фермент) УЧИМСЯ ОПРЕДЕЛЯТЬ МЕХАНИЗМ РЕАКЦИИ НП .И<г' " !.ц !и О<о.и И ии н <! <иьиии Чги. И и Н О! Ги,ши<и<ои.о! лы< в Комплекс фермента н продукта 2 Праду НΠ— С вЂ” СН ''() Диффузия второ!в иролуктя из актив- ш>го це!пра ирива- ,ип к рсгеисрзции Гиайа,"ик>п1 ф<.рм< ига.
1<П Н!" НΠ— С вЂ” СН вЂ” НН вЂ” АА„ '„' ) Н. .. Н. О!> "< ЭЛЕКТРО<2>ИЛЫ -:Н О-' Л гаы у! ле!юлз а карйоиильиой <ру>ик: (йолш злсктршприцзшлы<ый кислород карй<<икзьаой <ру!шы а гтя<шюш !>лйк трапы из се<а) ,с--,-йН 11ротаиироваииая ичииоГруп аз (агам уг>крола активировзи лля маки иуклш>филом) <Н О --О--Рспп ! (.> сг Фосфор фогфзп< ой груииы <Н 11! Про!пи —. О' ОЧ>в из гельма заряжсш <ый кислород(изиримср, в Лс.
иран>иироваииай гидроксильной <рушк <ми иоиизованной карбоксильиой груни<) — » О! ршшт< лыю я>ряжсаиая сульфг!Шрильиая группа —.С 1<зрй>зииаи (йп!аряжеиизя алииюгруииз Пмилззол Н- Ок Гилроьсид-иои л!ела<игам>л химических реакций.т. е. <брам>- кзвие и.рапюл кааалеишых сажей, цгюорюкаюпп с аамошыа тачек и и>юшугых с>р<юак. И>раж<швиц( ираиесс ыа репа !и и!си>рова' . Ка>пшхГП1!ш связь и)кк <таВЛЯЕт Пхлй! Сйайщсспь емшую пару Н изск!рашн;. Важаьк ллй мсхаиихпз 1ж1ай1ш ю<схтрзк!з.
Ис 1'ю<-п>тихи!к. в айрцовюаш «ш<зи. С<хаийчзки с >!амаяаяо тачек ("0111. 11югиу>ьх' ст)коши ( ) у<м!маада кз иаарзвл<пш* слкигв злсшроиаай вары. Пере; Ли<юсин шаюго .ьк к!раца (цаииимср, в сжххыар)ювка<!Ы(кц! р<акиии) изай!пжзсгся с иомшцью стрслкц в форме рыйолош!о!а лрю вп (, '). Н йолыишктве рсакииаииых спсшй цриицш>ки упг!Ис ипа!л<юеииые пары ъх кгршюв (ю!ь к мкхюиюис лекс гака ишатриип<иа). Ом!и ашюы хараюер!Ыпотся йаж с выкокай .!л<чщиатри!В<- т<шыюгтью, юм хруп<с, т, к аик пшьшт иршяпилнгг з>ккт(хны.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
