Osnovy_biokhimii_Nelson_i_Kokh_tom_1 (1123313), страница 92
Текст из файла (страница 92)
Е5. В любой момент времени в холе фермептативной реакции фермснт присутствует в двух формах — в свободной форме Е и в комплсксс с ферментом Е5. При низкой концентрации субстрата Гкьтьшая часть фермента находится в свободной форме (Е). При этом скорость реакции пропорциональна [5], поскольку равновесно, описываемое уравнением 6-7, по мере роста [5] слвигастся в сторону образования Е5.
Максимы>ьная скорость ферментативной реакции (Р .,„) лостнгастся, когда практически весь фериентсвязан в колшлексс Е5,а концентрация свободного фермента пренебрежимо мала. При атом фермент «насыщается» своим субстратом, так что дальнейшее увеличение [5] не влияет на скорость реакции. Данное состояние наблюдается, когда [5] достаточно велико, и весь свободный фермент переводится в форму Е5. В результате распада комплекса Е5 происходит образование продукта Р н высвобождение свободного фермента, готового катализировать превращение новой молекулы субстрата.
Эффект насыщения является отличительной чертой ферментатинного катализа; именно насыщенисм объясняется плато на рис. 6-11. Тип зависимости, изображенный ца рис. 6-11, иногда нж>ывают кинетикой насыщения. При смешивании фермента с изГ>ытком субстрата наблюдается так называемое предстационарное состояние, в котором происходит рост концентрации комплекса Е5. Этот период обычно слишком краток (несколько микросекунд), так что его нелегко зафиксировать в условиях эксперимента, и он ис виден на рис.
6-10. Реакция быстро псрехолит в стационарное состояние, при котором концентрация Е5 (и люГ>ых других интермелиатов) практически нс меняется со временем. Концепция стационарного состояния была предложена Е Э. Бриггсом и Дж. Б. С. Холлейном в 1925 г. Измсряелтт>е значение пп обычно соответствует стационарному состоянию, даже если определяется ца ранних этапах реакции, поэтому метод анализа начальных скоростей называется стационарной кинетикой. Количественное соотношение между концентрацией субстрата и скоростью реакции Зависимость между [5] и ть (рис.
6-11) лля большинства ферментов имеет один и тот же вил (стремится к равнобочной гиперболе), и сс алгебраическим выражснием является уравнение Михаэлиса — Мснтен. Мнхаэлис и Ментеп вывсли свое уравнение, опираясь все на тот жс постулат, что лимитирующая стадия фермснтативной реакции — распад комплекса Е5 с образовапислт пролукта и высвобождением фермента. Уравнение выглядит следующим оГ>разом: и» = !Я б! (6-9) Паралтстры [5], пп и $т, а также константа Михаэлиса (Км) являются важными характеристиками реакции и могут быть определены эксперименталыю. [288] Часть 1. б. Ферменты Теперь рассмотрим подробнее основные логические и алгебраические этапы вывода уравнения Михаэлиса — Ментен с учетом приближений стационарной кинетики, введенных Ьриггсом и Хо»дейном.
Для вывода уравнения запишем две основные схемы реакций, соотнстствун>шие образованию и распаду комплекса Е8 (уравнения 6-7 и 6-8). Па начальных этапах реакции концентрация продукта [Р] ничтожно мала, что позволяет пренебречь скоростьк> обратной реакции Р— Я (характеризуется константой [> з).
Это предположение нс является критическим, но сильно упрощает нашу задачу. В результате общее уравнсние реакции прилшт следующий вид: Е + 8 =' ЕЯ Е + Р (6-10) ь, Скорость э„определяется распадом комплекса ЕЯ и зависит от [Е8]: св = 7>> [Е81 (6-11) Поскольку [Еб] сложно определить экспериментально, следует выразить эрот параметр какимто другим образом. Прежде всего, введем параметр ]Е,], отражающий общую концентрацию фермента (сумму концентраций связанного в комплекс Е5 н свободного фермента). '1огда концентрацию свободного фермента можно определить как [Е,] — ]Еб]. Аналогичпысч образом, поскольку обычно [8]» [Е,], то в любой момент времени количсство субстрата, связанною в комплекс с ферментом, пренебрежимо мало по сравнснию с об>цей концентрацией 8. Помня об этол>, выразим вв через определяемые в эксперименте параметры, 1.
Скорости образования и распада комплекса Е8 определяются стадиями процесса с константами 7>> (образование) и 7> > + Йз (распад) в соответствии с выражениями: Скорость образования ЕЯ = Й> ([Е ] — [Е5]) [8] (6-12) Скорость распада Е8 = [> > [Е8] + к> [Е8] (6-13) 2. Теперь нам предстоит сделать важное допущение: начальная скорость реакции соответствует стационарному состоянию, при котором концентрация Е8 постоянна, т.
е. скорость образования ЕЯ равна скорости его распада. Математически это выражается следующим образом: л>([Е,] — [Еб]) [8] =л >]Е8]+7>2[Е8] (6-11) 3. Теперь перейдем к рсшепи>о уравнения (6-14) относительно [Е8]. Сначала раскроем скобки в левой части уравнения и вынесем за скобки ]Е8] в правой части: й,[Е,] [8] — й,[Е8] [8] =([> >+[>~) [ЕВ] (6-15) Прибавив к обеим частям уравнения выражение 7>> [Е8] [8] и упростив уравнение, получим следующее: >1> [Е,] [8] = (/г> ]8] + я > + йз) [Е8] (6-16) Теперь решим это уравнение относителыю ]Е8]: »,[Е,[[8[ [Е81 = ь,[51, >... >,> (6-17) Уравнение можно упростить, объединив все константы скоростей: [Е,[[81 [е81 = [ ~ ь ~ (6-18) Выражение (>> > + 1>2) / [>> называют константой Михаэлисв и обозначают Км.
Подставляя Км в уравнснис 6-18, получаем [Г.,[[81 1~~[ (6-19) 4. Теперь можно выразить скорость >д через [Еб]. Подставляя правую часть уравнения 6-19 вместо [Е8] в уравнении 6-11, получаем: в 'а = (6-20) Данное уравнение можно упростить. Поскольку при насыщении фермента (т.
е. при [Е8] = [Е,]) достигается максимальная скорость реакции, то Г„, можно определить как Йз]Е,]. Подставляя это в уравнение 6-20, получаем уравнение 6-9: ч>[Е,[[81 км + [81 Это и есть уравнение Михаэлиса — Ментен, т. е. уравнение скорости односубстратной ферментативной реакции. Оно выражает количественное соотношение между начальной скоростью реакции г>„, максимальной скоростью Г . и исходной концентрацией субстрата ]8], которые 6.3 4>ерментативная кинетнка хак подход к пониманию механизма действия ферментов [289] Рис. 6-12. Зависимость начальной скорости от концентрации субстрата.
На графике отражены кинетические параметры, ограничивающие данную кривую при высоких и низких значениях [6]. При низких значениях концентрации субстрата Кк х [6], и значением [6] в знаменателе уравнения 6-9 можно пренебречь. В таком случае уравнение приводится к виду хо - У [6]/ Кю и хо линейным образом зависит от [6], как и следует из рисунка.
При высоких значениях [6] наблюдается соотношение Ки «[6]; в таком случае в знаменателе уравнения 6-9 можно пренебречь значением Кн и принести уравнение к виду го - У„. Это состояние соответствует плато на графине при высоких значениях [6]. Таким образом, уравнение Михазлиса-Ментен согласуется с экспериментальной зависимостью хо от [6], а форма кривой ограничивается значением У / Ки при низких концентрациях субстрата и значением У при высоких концентрациях субстрата. х х х !9! (хм) Уравнение Михаэлнса — Ментен 6>[Б>[[6! Км + [6! можно преобразовать алгебраическим способом в другую форму, более удобнук> для анализа эксперние>пахьных данных. Одно из наиболее часто используемых прет>бразований состоит в том, что обе части уравнения переворачивают, что приводит уравнение к следующему виду: 1 Км+ [6! оо Уо«! ! Рззделнв числитель в правой части уравнения на составляющие, получаем Км [9! го У„,.
[6] У „„[6! Данная форма записи уравнения Мнхаэлнса-Ментен хюывается уравнением Лайнунвера †Бер. Для ферментов, подчиняющихся кинстике Михаэлиса— Мсптен, график зависимости 1/по от 1/[Я] (в лвойных обратных координатах по отношению к использованным ранее координатам по от [Б]) представляет собой врямух> линию (рис. 1). Угол наклона прямой равен Ки/ У,„; точка пересечения прямой с осью ординат соотхстствуег 1/У,„, а точка пересечсння с осью абсцисс и в рсзулыате упрощения прях>>дим следующему: 1 Км [6! о У„„„ [6! У [6! соответствует — 1/Кч. График в двойных обратных координатах, называемый также графиком Лайнуивера— Берка, позволяет более точно опрелслить величину 1'„,, которую в обычных координатах оо от [Б] можно оценить лишь приблизитап по (см.
рис. 6-12). Су>цествуют н другие способы преобразования уравнения Михазлнса — Мептсн, причем каждый из ннх ил>ест определенные преимущества для анализа»кспернмснтальных данных (см. звлачу 14 в конце ланной главы). Графики в двойных обратных координатах чрезвычайно полезны для выявления различий в механизмах фермеп тати нного катализа (си. рис.
6-14) и анализа ингнбирования ферл>ентатнвных реакций (доп. 6-2). Рис. 1. График в двойных обратных координатах (график Лайнуивера-Берка). [290[ Часть1. 6. Ферменты ьг+ е К м ь, (6-24) связаны между собой через константу Михаэлиса Км. Заметьте, что константа Михаэлиса имеет размерность концентрации. Соответствует ли данное уравнение экспериментальным наблюдениям? Да, соответствует, и это можно показать, рассматривая граничные условия, котла [6] принимает очень большие или очень малые значения (рис.
6-12). Важное численное соотношение, вытекая>щсс из уравнения Михаэлиса — Ментен, наблюдается в частном случае, когда начальная скорость равна половине максимальной скорости (рис. 6-12): У„, У „[Я 2 К,ь[Я (6-21) Раздслив обе части уравнения на У„„.,„, получаем: 1 1Я 2 км+1х! (6-22) Решим это уравнение относительно Км. Получим Км + [3[ = 2[3] нли 1 К =Р1,«л = — 1'. (6-23) Это опрсдслсние Км очень важно для практического использования: константа Михазлиса соответствует концентрации субстрата, при которой начальная скорость реакции ранна половине максимальной скорости. Уравнение Михаэлиса — Ментен (уравнение 6-9) алгебраическим путем можно преобразовать к виду, удобному для практического определения Кн и У .„, (доп.
6-1), а также для анализа действия ингибиторов (доп. 6-2 на с. 296). Использование кинетических параметров для сравнения активностей ферментов Важно понимать различие между уравнением Михаэлиса — Ментен и тем частным кинетическим механизмом, для которого оно исходно было получено. Данное уравнение описывает кинетическое поведение огромного большинства ферментов, и про все ферменты с гиперболической зависимостью 16 от [Я] говорят, что они подчиняются кинетике Мнхаэлиса — Ментен. Практическое правило, что Км = [5] при 1~в = 1/2 1' (уравнение 6-23), соблюдается для всех ферментов, подчиняющихся кинетике Михаэлиса — Ментен. Наиболее важным исключением являются регуляторные фермен- ты, нс подчиняющиеся этой кинстике (разя. 6.5).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
