Osnovy_biokhimii_Nelson_i_Kokh_tom_1 (1123313), страница 96
Текст из файла (страница 96)
Поэтому лекарства, созданные <щ основании дапнопэ подхода, оказывают заметно меньшс побочных эффектов (см. доп. 22-3). Несколько примеров необратимых ипгибиторов, важных для медицины, приведены в конце разд. 6А. Зависимость ферментативной активности от рН фсрл<снты характеризуются оптимальным значением или диапазоном значений рН, при котором их активность максимальна (рис. б-!7); при отклонении значений рН в болыпую или меньшую сторону активность фермента снижается. Ничего удивительного в этом явлении нет.
Боковыс цепи аминокнслотных остатков в активном центра фермента могут проявлять свойства слабых кислот или оснований, функционирование которых зависит от их состояния ионизацин. Кроме того„ ионизовапныс боковые цепи во всей молекуле фермента могут принимать активное участие в поддержании структуры белка. Наприл<ер, удаление протона от остатка гисгидина может разрушить ионное взаимодействие, важное для стабилизации активной конформации фермснта. Менее распространенной причиной чувствительности фсрментативпой реакции к изменениям рН является реакция нейтрализации (титрование) группы в составе молекулы субстрата.
Диапазон рН, в котором происходит изменение активности фермента, может указывать па тип аминокнслотных остатков, участвующих в катализе (табл. 3-1). Например, изменение активности фермента в области рН 7,0 может говорить а нейтрализации (титровании) остатка Ннь Однако интерпретировать влияние рН следует с осторожностью. Внутри молекулы белка значснис рК, аминокислотпого остатка может быть сильно изменено. Например, локализованный поблизости положитсльный заряд может снизить рК., остатка 1уэ, а отрицательный заряд может повысить его значение рК, Подобные эффекты часто приводят к тому, что значение рК,. сдвигается на несколько 2 4 6 6 1О рН Рис.
6-17. Зависимость аитивиости двух ферментов от рн. Данные кривые построены на основании измерения начальных скоростей реакции в буферах с различными значениями рН. Пасхальну РН вЂ” это логарифмическая величина, единица которой отражает десятикратное изменение концентрации протонов, то значения и, также откладывали на логарифмической шкале. Оптимальное значение рН для активности фермента обычно лежит в тои диапазоне рН, в котором фермент функционирует в физиологических условиях. а) Пенсии, расщепляющий определенные пептидные связи в белках в процессе пищеварения в желудке, имеет рН оптимум активносги ахала 1,6.
Значение рН желудочного сака колеблется между 1 и 2. 6) Глюкоза-6-фосфатаэа гепатацитав (клеток печени) имеет рН-оптииуи акала 7,6; этот фермент отвечает эа поступление в кровь глюкозы. Нариальнмй рН в цито- зале гепатоцитав составляет примерно 7.2. единиц рН по отношению к значению для свободной аминокислоты. Например, рК, одного остатка 1.уз в ацетоацстатдекарбоксилазе составляет 6,6 (в свободном лизине — 10,5), что связано с алектростатическим влиянием расположенных поблизости положительных зарядов. Краткое содержание раздела б.З ФЕРМЕНТАТИВНАЯ КИНЕТИКА КАК ПОДХОД К ПОНИМАНИЮ МЕХАНИЗМА ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ ° Болыпннство ферментов характеризуются общим набором кинетическим параметров.
При добавлении субстрата к фсрмснту происходит быстрая реакция, и достигается стационарное состояние, при котором скорости образования и распада промежуточного комплекса Е5 равны. При увеличении концентрации субстрата и постоянной концентрации фермента активность фермента возрастает по 1ЗОО] Часть1. б. Фериеиты гиперболической функции и приближается к максимальному значению $',„, при котором практически весь фермент находится в комплексе с субстратом.
Концентрация субстрата, при которой достигается половина максимальной скорости реакции, называется константой Михаэлиса (Км), которая характеризует данный фермент по отношению к данному субстрату. Уравнение Михаэлиса — Ментен связывает начальную скорость реакции с 1Я и и .
через константу Михаэлиса. Кинетику Михаэлиса — Ментен иначе называют стационарной кинетикой. Разные ферменты характеризуются различными значениями Км и У„, Скорость лимитирующей стадии ферментативной реакции при насыщении описывается константой я„„ называемой числом оборотов. Отношение я„/ Км является удобной мерой каталитической эффективности фермента.
Уравнение Михаэлиса — Ментен также применимо к двухсубстратпым реакциям, протекающим через образование тройного комплекса или по механизму «пинг-поить (двойного замещения). Обратимое ингибированис фермента может иметь конкурентный, бесконкурентный или смешанный механизм. Конкурентные ингибиторы конкурируют с субстратом за связывание в активном центре фермента, но не подвергаются дальнейшим превращениям. Бесконкурентные ингибиторы связываются только с комплексом ЕБ, причем связывание происходит вне активного центра фермента. При смешанном характере ингибирования ингибитор связывается как с Е, так и с ЕЯ, опять же вне активного центра. При необратимом ингибировании ипгибитор связывается с активным центром фермента путем образования ковалентных или очень прочных нековалентных связей. Каждый фермент характеризуется оптимальным значением или диапазоном рН, при котором его активность максимальна.
6.4. Примеры ферментативных реакций До сих пор мы говорили об общих принципах катализа и ввели нскоторыс кинетические параметры для описания действия ферментов. Теперь перейдем к рассмотрению отдельных примеров механизмов ферментативных реакций. Для полного понимания механизма лействия выделенного фермента необходимо идентифицировать все его субстраты, кофакторы, продукты и регуляторные молекулы.
Более того, необходимо узнать 1) порядок стадий ферментативной реакции, 2) структуру каждого промежуточного соединения (интермсдиата), 3) скорости взаимных превращений интермедиатов, 4) структурные взаимоотношения фермента с каждым интермедиатом, 5) энергетический вклад каждой связи, образующейся в промежуточных комплексах и переходных состояниях. На сегодняшний день, вероятно, нет ни одного фермента, для которого ответы на все эти вопросы были бы получены.
Однако десятки лет исследовательской работы привели к накоплению большого количества информации, в некоторых случаях весьма подробной, о механизмах действия сотен ферментов. Далее мы остановимся на механизмах действия четырех ферментов: химотрипсипа, гексокиназы, енолазы и лизоцима. Эти примеры, безусловно, пе могут отразить всс мнопюбразие ферментативных реакций. Подобный выбор объясняется отчасти тем, что эти ферменты относятся к разряду наиболее изученных, кроме того, на их примере удобно проиллюстрировать некоторые общие принципы, описанные в данной главе.
При обсуждении принципов действия ферментов мы будем говорить и о ключевых экспериментах, которые позволили их установить. На примере химотрипсина мы еще раз остановимся на тех правилах, которые используются для описания механизмов ферментативных реакций. Многие Летали механизмов и экспериментальных данных, конечно, приходится опускать, поскольку ни одна книга не смогла бы вместить в себя всю богатейшую историю экспериментов по изучению этих ферментов. Кроме того, здесь мы не будем специально останавливаться на роли коферментов в ферментативной реакции.
Различным функциям коферментов болыпе внимании будет уделено в части П. Механизм действия химотрипсина включает стадии ацилирования к деацилирования остатка серина Химотрипсин из поджслулочной железы быка (Ч, = 26 191) является протеазой — ферментом, катализирукппим расщепление пептилцой связи.
Данная протеаза специфическим образом расщепляет псптилные связи, которыми соединены остатки ароматических аминокислот (Тгр, РЬе и Туг). На рнс. 6-18 представлена трехмерная структура химотрипсипа и отмечены фупкцнональныс группы в его активном центре. Реакция, катализирусмая данным ферментом, иллк!стрирует принцип стабилизации переходного Пень Л 16 „В !1Ы" 4! линю ' — -*- ! 122 Пель В Рис.
6-18. Структура химотрипсина (РОВ 10 76СН). а) Первичная структура белка на которой отмечены дисульфидные связи и важные длл катализа аминокислотные остатки. Белок образован тремя полипептидными цепями, соединеннымн дисульфидными мостиками (нумерация остатков химотрипсина с еотсутствующими» остатками 14, 15, 147 и 148 объясняется на рис. 6-38). В трехмерной структуре белка аминокислотные остатки, образующие активный центр, сгруппированы вместе.
6) Изображение поверхности белка. Зеленым цветом выделен карман, в котором происходит связывание ароматической боновой цепи аминокислотного остатка субстрата. Красным цветом выделены ключевые остатки активного центра: Беги!, Н(ээУ и Аэрм'. Роль этих остатков в катализе отражена на рис. 6-21. в) Полипептидный остов белка изображен в виде ленты. Днсульфидные связи выделены желтым цветом, а три полнпептидные цепи изображены теми же цветами, что и на рисунке (а).
г) Закрытие активного центра при связывании субстрата (основная часть изображена зеленым цветом). Часгнчно видны два остатка активного центра — Бег'и и Н(ээ! (красные). Гндроксильнал группа Бе!ив атакует карбонильную группу субстрата (кисаород карбонильной группы выделен сиреневым цветом); образующийся на кислороде отрицательный эаряд сгабилиэнруется в полости, образованной амидными атомами азота (в том числе ет Бег!!', показанного оранжевым цветом), как объясняется на рис. 6-21. Синим цветом изображены боковая цепь ароматического аминокнслетного остатка и амидный азот расщепляемой пептидной связи (направлены в сторону к читателю и закрывают собой остальную полипептидную цепь субстрата).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
