Osnovy_biokhimii_Nelson_i_Kokh_tom_1 (1123313), страница 99
Текст из файла (страница 99)
Именно этого эффекта и следует ожидать в том случае. если взаимодействие между ферментом и субстратом больше влияет на стабилизацию переходного состояния. Данные результаты также показывают, что скорость реакции в значительной степени зависит от фермент-субстратпых взаимодействий, происходящих в участках, удаленных от реагирующих групп. Более подробно механизм действия химотринсина описан в основном тексте. Гидролнэ сложного эфира к'6 о Ок Переходное состояние , О" к'1 о Р Кк 1 о„ Лналог (эфир фосфоноэой кислоты) Гидролна кврбонвта к ОН о Н— Н Ол- >!оокалько †" †" + !!ролукты Переходное состояние Дополнительным методом анализа может служить молификацня самого ферме>гга, приводяп>ая к ликвидации некоторых фермент-субстратных взаимодействий.
Зто> о можно добиться, вызывая замены определеннь>х аминокнслотных остатков путем направленного мутагспсза (рис. 9-11). Результаты полобных экспериментов также демонстрируют важность энергии связывания для стабилизации переходного состояния. Аналоги переходного состояния Даже если перехолнос состояние нельзя увидеть непосредственно, химик часто может предсказать его примерную структуру, основываясь на ланных о механизме реакции. Переходное состояние по опрелсленню является временным и настолько неустойчивым, что прямые измерения взаимодействий между интермедиатом и ферментол! ие представлякггся возможными. Однако в некоторых случаях удается создать устойчивые молекулы, структура которых напоминает переходное состояние.
Их называют аналогами переходного состояния. В принципе, зти вещества лолжны связываться с ферментом более прочно, чсм связан субстрат в комплексе Е5, поскольку они лучше соответствуют структуре активного цсптра (т. е. образуют большее количество слабых свнзей), чем сам субстрат. Идея создания аналогов перехолного состояния Г>ыла выскааана Полингом в 1940-х гг. и воакощепа в жизнь для нескольких ферментов. Ограничением данного подхода является то, что аналоги не могут абсолютно п>чно имитировать переходнос состояние. Некоторые нз них связываются с ферментом в 10' — 10' раз прочнее, чем обычныс субстраты, что служит докж>ательством комплементарности активного цснтра фермента именно переходнок>у состояникь Тот же принцип испатьзуется сегодня в фармацевтической промышленности прн создании новых лекарственных препаратов.
Мощные лекарства, направленные на Гюрьбу с ВИЧ- инфекцией, — ингибиторы протеаз — создавались как прочно связываюп>неся аналоги переходного состояния для связывания с активным центром протеазы ВИЧ. Каталитические антитела Если можно создать аналог переходного состояния для реакции Б — Р то антитела, прочно связывающиеся с этими впало>амн, возможно, окажутся способными катализнровать реакцию Я Р. Антитела (или нмму- 6.4 Примеры ферментатнвных реакций 1307] л ОН несколько К> (л О ~ — ь Пролукты с кв 3 о ОН Н о О >ко Н О" о 10 Х Н 3 Ок . 1>! О> Лналог (эфир фосфорной кислоты) Рис 2.
Предполагаемые переходные состояния для реакций гндролнэа сложных эфиров и карбонатов. Хорошими ана- логами переходного состояния для этих реакций являются эфиры фосфоиовой и фосфорной кислоты соответственна 1звв] Часть 1. 6. Ферменты и к»». » Н Н ОН !»-О-глюкоза П ОН глюкоз>арф«гфат ноглобулины, рис.
5-23) играют ключевую роль в действии ик|мунной системы. Если аналог псреходноп> с<>стояния использовать в качестве энитона Лля стн- мулявин нролукции антител, то связывающнеся с ним антитела являкпся потенциальными катализаторами соответствукияей реакции. Ис<»оль;к>навис таких «каталитичсских антител» (их часто называют абзимами от англ.
алг>!Ыу и <ч>гв>яе. — Прим. ред.) впервые было предложено В. П. Дженксом в 1969 г. и вошло в практику с рж|витисм лабораторных методов, позволя к>щих получать достаточные количества идентичных антител, связывающихся с одним специфическим антигоном (мо»<оклоиазьных антител, гл. 5). Пионерные работы, выполненные в лабораториях Ричарда Лернера и Петера П! ульца, привели к выделению ряда моноклональных антител, катализирующих гидролиз сложных эфиров или карбонатов (рис. 2). В этих реакциях в результате атаки воды (ОН ) на карбонильный углерод образуется четвертичное перехолное состояние, в котором на карбонильном атоме кислорола Индуцированное соответствие при связывании субстрата с гексокиназой Гсксокиназа дрожжей (М, = 107 862) катализиру- ет обратимую двухсубстратпую реакцию: Мя.
АТР СП«ОН СН ОРГ»1 Мя АОР ОН Н ОН АТР и А()Р всегда связыва»отся с ферментами в виде комплексов с ионами Мйз . Гидроксильная груши у атома С-6 глюкозы (на которую в процессе фермснтативной реакции переносится т-фосфорильная группа АТР) по реакционной способности близка к воде; кроме того, вода легко проникает в активный центр фермента. Однако присутствие гексокиназы в 10в раз повышает вероятность протекания реакции с глюкозой.
Способность фермента различать воду и глюкозу связана с конформационными измснс- сосрелоточен ча< тичный отрицательный заряд. Эфиры ф<юфоновой кислоты похожи н<> структуре и заряду на переходное состояние в реакции п»др<миза сложных эфиров, что делает возможныл< их использование в качестве аналоп>в переходного состояния. Для гидролиза карбонатов используются эфиры фосфорной кислоты. Было обнаружено, что прочно связывак>щиеся с фосфонатами или фосфатами антитела ускоряют соответствующие реакции гидролиза сложного эфира или карбоната в 1О> — 1О" раз.
Структурный анализ нескольких из этих катал итичсских а| ггитсл показал, что боковые цени определенных аминокислотных остатков расположены таким образом, что они могли бы взаимодействовать с субстратом в переходном состоянии. Катю>итические антитела обычно ие д<хтнгают каталитической эффективности ферментов, однако >вазможность их медицинского и промышленного применен>и очевидна. Например, было прелложено использовать катааитические антитела, с<х>данные лля деградации ком»ина, при лечении кокаиновой зави< имости. ниями н его молекуле, происходящиъш нри связывании «правильного» субстрата (рис. 6-22). Такил» образом, механизм действия гсксокиназы является хорошим примером индуцированного соответствия. Если в среде нет глюкозы, то фермент пребывает в неактивном состоянии, когда аминокислотные остатки активного центра находятся в нереакционцоснособцом положении. При связывании глюкозы (но нс воды) и Мя АТР образуюн»аяся энергия связывания приводит к конформационным изменениям в молекуле гсксокиназы, переводящим ее в активное состояние.
Данная модель была подтверждена кинетическими исследованиями. Пятиуглеродный сахар ксилоза, но стерсохимнческим свойствам напоминающий глюкозу, но содержащий на один атом углерода меньше, связывается с гексокиназой, но не может фосфорилироваться. Тем не менее добавление в реакционную смесь ксилозы увеличивает скорость гидролиза АТР Очевидно, связывания ксилозы достаточно, чтобы вызвать переход гексокнназы в активное конформационное состояние, и «обманутый» ферыент фосфорилирует волу. Эта реакция гексокиназы также демонстрирует, что специфичность фермента нс всегда заключается Рис.
6-22. Иидуцироваиное соответствие в молекуле гексокииазы. а) Гексокииаза имеет 0-образную форму (РОВ 10 2УНХ). 6) Связывание 0-глюкозы (аыделеиа красным цветом) при- водит к коиформациоииым изменениям, солроаождающимсл соединением двух концов моле- кулы (РОВ 101НК6 и РОВ10161К). Механизм реакции енолазы требует присутствия ионов металла С О ! !! Н вЂ” С вЂ” Π— Р— О НΠ— СН О С О ! !! С вЂ” О-Р— О-+ Н,О !! ! СН О' Фосфоеиолпируаат 2-Фосфоглииерат Ксилоза в связывании одного-единственного вещества.
В данном случае специфичность фермента нс в образовании комплекса Е5, а в отношении скоростей последующих каталитичсских стадий. Для проникновения волы в активный центр нет препятствий, но скорость реакции сильно возрастает в присутствии функционального акпсптора фосфорильной группы (глюкозы). Н О ', сл С ! Н вЂ” С вЂ” ОН ! НΠ— С вЂ” Н ! Н вЂ” С вЂ” ОН ! СН ОН Н О л С ! Н вЂ” С вЂ” ОН ! НΠ— С вЂ” Н ! Н вЂ” С вЂ” ОН ! Н вЂ” С вЂ” ОН СН ОН Глюкоза Ицдуцированнос соответствие является лишь одним аспектом механизма действия гексокипазы.
Подобно химотрипсицу, этот фермент также использует несколько стратегий катализа. Например, аминокислотные остатки активного центра (те, что принимают правильное положение в результате конформационных изменений при связывании субстрата) участвуют в общем кислотно-основном катализе н стабилизации переходного состояния. 6.4 Примеры фермеитативиых реакций [309] Еще олин гликолитический фермент — енола- за — катализирует обратимую легидратацию 2-фосфоглицерата с образованием фосфоенол- пирувата: Енолаза дрожжей (М, = 93 316) представляет собой димер, каждая субъединица которого состоит из 436 аминокислотных остатков. Ферментативная реакция с участием енолазы иллюстрирует олин из типов катализа с участием ионов металлов, а также является еще одним примером общего кислотно-основного катализа и стабилизации перехолного состояния.
Реакция протекает в две стадии (рис. 6-23, и). Сначала остаток Еуз мз лействует в качестве общего основания, отнимая протон от атома С-2 2-фосфоглицерата. Затем остаток 0(цац вы- 1310] Чапь 1. 6. Ферменты О1пзн Рис. 6-23. Механизм реакции. Двухстадийная реакция, катализируемая енолазой. о) Механизм превращения 2-фосфоглицерата (2-ФГ) в фосфоенолпируват. Карбоксильная группа 2-ФГ координирована двумя ионами магния в активном центре фермента. 6) Положение субстрата, ионов М92; 1узм' и б)пп' в активном центре енолазы.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
