Osnovy_biokhimii_Nelson_i_Kokh_tom_1 (1123313), страница 100
Текст из файла (страница 100)
Атомы водорода не показаны. Все атомы кислорода в молекуле 2-ФГ изображены розовым цветом, а атом фосфора — оранжевым (РВВ 10 10НЕ). а мз 1.уз ' по механизму общего Основного кзМахх РОз твлнзв отнимает протон '.. )г~ О Н ', Дзз иона МВ 'стзбили2+ зируют обрззующееся Мах ., С С С Н енольиос промежуточ" т'-! ! Еиолззв ' О Н ОН .' нос соелииеис. ' г но о Н вЂ” 11 — Н ' е' о ! С 1, з«з ! 1.р О!омг 2-ФОсцюглиперзт, связанный с ферментом ступает в роли общей кислоты и отдает протон уходящей ОН-группе. Протон в С-2 положении 2-фосфоглицерата не очень «кислый» и поэтому не слишком легко удаляется. Однако в активном центре фермента 2-фосфоглицерат участвует в довольно сильных ионных взаимодействиях с двумя связанными ионами Мйз (рис. 6-23, б).
В результате протон у атома С-2 становится более «кислым» (снижается значение рКз) и удаляется легче. В каталитическом механизме задействованы также водородные связи с участием других амипокислотных остатков активного центра. Различные взаимодействия приводят к эффективной стабилизации как енольного промежуточного соединения, так и переходного состояния, предшествующего его образованию. О! Ом' облегчает а«2 уход -ОН группы по механизму общего Г .— О О Н ' кислОтнОГО катализа.
! ! РО2- Миз-.'.',: (.ь С ~~ — С вЂ” Н з ОН НОН О О Н ! Н вЂ” Х+ — Н ' » ~Да С О н ззз Ео СВИ222 Епольпое промежуточиос соелипспие Фосфоеполпируззг Механизм действия лизоцима включает две последовательные стадии н))клеофильного замещения Лизоцим — это природное антибактериальное вещество, присутствующее в слезах и яичном белке. Лизоцим куриного белка (М„= 14 296) представляет собой мономер, состоящий из 129 амннокнслотных остатков. Он был первым ферментом, для которого в 1965 г. Дзвид Филлипс с сотрудниками определили трехмерную структуру. Молекулализоцима удерживается четырьмя лисульфнлными мостиками и имеетллиннуюрасщслину, вкоторой расположен его активный центр (рис. 6-24, а).
Более пяти десятилетий активного изучения лнзоцима привели к созданию летальной картины, отражающей его структуру и активность; эти ис- Рис. 6-24. Структура лизоцима яичного белка и катализируемая им реакция. а) Ленточная модель структуры белка: остатки 61пзз и Азр" в активном центре фермента изображены в виде синих стержней, а связанный субпрат выделен красным цветом (РОВ!О 11хЕ). 6) Реакция, кагализируемая лизоцииом яичного белка. Изображен фрагмент пептндогликана с указаниеи участков связывания в молекуле фермента обозначенных буквами от А до Г.
Краснан стрелка указывает на расщепляеиую гликозидную связь С-О, расположенную между остатками сахаров, локализованных в участках связывания О и Е. Во вставке изображена сама реакция; красным цветом выделен кислород происходящий из молекулы воды. Принятые сокращения: КпгВАс — К-ацетилмурамоеая кислота, 61<КАс — К-ацетилглюкозамин, ДΠ— остаток молочной кислоты, КАс и Аси— К-ацетильная группа. сзелования являются показателем развития биохпиической науки.
Субстр<тгаь<и лизоцима служат псптилогликаны — углеводы, обнаруженные в клеточных стенках многих бактерий (см. рис. 20-31). Лизоцим расщепляет)т! - 4гликозилнуюС вЂ” Освязь(см.с.348) 6.4 Примеры ферментатнвных реакций [3111 между двумя типами остатков сахара в ьпьтекулс: остатками Х-ацетилмурамовой кислоты (Мпг2Ас) и )ч-ацетгьтглюкозамина (С!сХА< ), которые часто обозначают соответственно как ХАМ и )чАС (рис. 6-24, б). Шесть чередующихся остатков этих сахаров в молекуле пептилогликана связываются [312[ Часть 1.
6. Ферменты Пептнлоглнквн снязынается в активном пснтрс „ лнзапимз Мехзннзм ли Г 0!ам Овззв Л Ос01 сн,он Асн Н О О Лизопим У сн он 0 сн он О Аврю б Н ыгизаппм А„рвв Н Н ХАс ый укт Н ХАс ый укт Прал~ежутачнас сасдинсннс глнказильный карбокатиан 01авв ,Л, — о Он~з !Г 0 — Н Н 1 ОН Н -О О '1" СН,ОН А ш НО Асн Второй продукт О,О А вв Рис. 6-25. Механизм реакции. Действие лиэоцима. В результате данной реакции вода, присоединяющаяся к атому С-1 Маг2дс в составе продукта, имеет ту же конфигурацию, что и исходная гликозидная связь. Таким образом, данная реакция является реакцией замещения с сохранением конфигурации. а) Два механиэмц предложенные для описания данной реакции.
Слева изображен предложенный Филлипсом механизм 5„1-типа. Изображенный справа механизи 5„2-типа лучше согласуется с современными экспериментальными данными. 6) Поверхность активного центра лизоцима с шаростержневой моделью коаалентного фермент-субстратного промежуточного соединения. Боковые цепи в сопаве активного центра показаны как шаро стержневые структуры, отходящие от ленточных структур (РРВ 10 1Н 6М). В результате перегруппир- овкин образуется глнка- знльный карбакатиан. Па механизму общего кнс- лапюга катализа С1агз пратанируст замещаемый атом кнслоралз С!сХЛс н облегчает его уход.
С 2фтарт Капалентнас промежуточное саелинсннс связывзстсл н активном центре. Общий основной катализ с помощью С1амаблегчзет атаку гликазильнага кзрбакзтнана молекулой залы; образуется продукт. Аврвт ел~ступает кзк ка- налсптный катализатор, непасрслстнеппа вы- тесняя С1сХзс по меха- низму Бь2.
С!иж пратанн- руст С)сХзс, чта облег- чает его уход. 01авв 0 0 Н 1 Коязлентнос прамежутачнас соединение Асн 0 0 ')" Аврлв С!плвзыгтупзет кзк общий катализатор, облегчающий 5н2 этаку залы, вытесняя Аьчрвг н образуя продукт. 6.4 Примеры фермеитативиых реакций 1313] в активнол> центре фермента в позициях, обозначаемых буквами от А до Е Исследования на модельных структурах показали, что боковая цснь Х-ацетилмурамовой кислоты не позволяет этому остатку связываться в позициях С н Е, а только в В, П или Е При связывании нснтилогликана расщепляется лишь одна гликозидная связь, соедипя>ощая остаток !л1-ацстилмурамовой кислоты в положении 1) и остаток !л1-ацетилглюкозал>нна в положении Е. Ключевыми аминокислотными остатками фермента являются С!паз и Азрла (рис.
6-25, а). Реакция идет но механизму нуклеофильного замещения: ОН-груп~а воды замещает остаток !л1-ацетилглюкозамина у С-1 атома !>1-ацетилл>урамовой кислоты. Казалось, что после идентификации аминокислотных остатков активного центра и детально>о изучения структуры белка в 1960-х п. механизм действия лизоцима стал ясен. Однако окончательное понимание этого механизма пришло лишь почти через сорок лет. Существует два возможных пути протекания реакции, приводящих к образованию продуктов гидролиза гликозидной связи. Филлипс с сотрудниками предполагали, что реакция идет но диссоциативному 5х1-тину (рис. 6-25, а, сл>ева), при котором С!с!л!Ас сначала диссоциирует (стадия 1) с образованием карбокатпопного интсрмедиата.
В данной схел>е ухолящий С!гас протонируется в соответствии с механизмом общего кислотного катализа цри участии С!пз, расположенного в гидрофобцом кармане, что сообщает его карбоксильной группе необычно высокое значение рК». Карбокатион стабилизируется за счет резонансной структуры с участием кислорода шестичлснного колы>а, а также электростатических взаимодействий с отрицательным зарядом па соседнем Авр».
На стадии 2 вода атакует атом С-1 Мпг2Ас, в результате образуется продукт. Ьльтернативнь>й механизм (рис. 6-25, а, справа) включает в себя две носледовательпыс стадии замещения 5л2-типа. На стадии 1 Ахрз> атакует атом С-1 Мпг2Ас и вытесняет С!с!>!Ас. Как и в первом иеханизмс, С!п>в выступает в качестве общей кислаты и нротонируст уходящий С!с)л!Ас. На стадии 2 вода атакует атом С-1 Мпг2Ас, что приводит к вытеснению Азрга и образованию продукта.
Механизл>, предложенный Филлинсом (5 1- типа), признавался большинством исследователей па протяжении более т!юх десятилетий. Однако сохранялись некоторые противоречия, и работа в дан- ном направлении продолжалась. Методы анализа иногда развиваются слишком медленно, и бываег трудно поставить эксперимент, который бы нрялю ответил на поставленный вопрос. Некоторые аргументы против гипотезы Филлинса ставили ее под сомнение, но не были особенно убедительны. Например,нооценкам, времяполураспада глик>хзильного катиона должно было составлять 10 " с, т.
е. больше, чем период колебания молекулы, но недостаточно для диффузии других молекул. Еще более важно, что лизоцим является членом семейства ферментов, сохраняющих аномерную конфигурацию продукта такой же, какая Г>ыла у субстрата (об аномерных конфигурациях углеводов см. гл. 7). Про все эти ферменты известно, что 1х.акции с их участием протекают с образованием ковалецтного промежуточного н)юдукта, аналоп>чного тому, что мог бы возникать цри альтернативном механизме действия лизоцима (5к2-тина). Таким образом, механизм Филлиса противоречил экспериментальным данным для бл>сзкородствецных белков.
Экснерил>снт, проведенный Стефеном Уитерсом с сотрудниками в 2001 г., окончательно сдвинул чашу вссов в пользу Вы2-механизма. Используя мутантный фермент (в котором С!п>в был заменен С1н) и искусственный субстрат, что позволило снизить скорость ключевых стадий реакции, удалось стабилизировать ковалентное промежуточное соединение и изучить его напрямую с помощью методов масс-снсктрометрии и рентгенокристаллографии (рис. 6-25, 6). Можно ли сказать, что механизл> действия лизоцима доказан? Нет. Одной из особенностей научного подхода к решению проблемы, как говорил Альберт Эйнштейн, является то, что иникакое количество зксцсрил>ента»ьнь>х данных не может доказать, что данное утверждение верно, но всего лишь один эксперимент может доказать, что оно ошибочно».
В случае механизма действия лизоцима кто-то может возразить (и уже возражали), что использование искусственных субстратов с атомами фтора у атомов С-1 и С-2, введе>шыми для стабилизации ковалснтного интермсдиата, могло изменить путь реакции. Сильноэлектроотрицательный фтор мог дестабилизировать и без того электронодефицитный карбениевый ион интермедиата, возникший нри реализации механизма Вм1-тина. И тем не менее на сегодняшний день Вк2-механизм лучше описывает существующие экспериментальные данные.
1314] Часть 1. б. Фериенгы ):йв о-О)е н н — (о)у) — н — о ьу ) н с=о )чн ! НС вЂ” СНв о-А)в З . — Он~во=с ) ! ,,;," -.-., 'внн 'Гтввдм)(6(В)ай НС вЂ” СНв а.А)в 1 соо- Цепь пептидоглнкана 1 О-А)в "+Ф вЂ” ~в-)г . Понимание механизмов действия ферментов стимулирует развитие медицины И Боплшинство лекарств, применяемых для лечения различных болезней — от головной боли до ВИЧ-инфекции, представляют собой ингибиторы ферментов. Здесь мь) рассмотрим два примера: антибиотик пенициллин (и его производные) н ингибиторы протеаз, используемые лля лечения ВИЧ-инфекции; эти препараты являются необратимыми ипгибиторами ферментов. Пенициллин был открыт Александром Флеми игом в 1928 г., но прошло еще 15 лет, прежде чем это сравнительно нестойкое вещество изучили настолько хорошо, что смогли использовать в качестве лекарства для лечения бактериальных инфекций.
Пенициллин блокирует синтез пептидогликана(см. гл. 20; рис. 20-32)— основного компонента жесткой клеточной стенки, которая прелохраняет бактерии от осмотического лизнса. Пептилогликан образуется в результате перекрестного сшивания полисахаридов и пептидов при участии фермента транспептидазы (рис. 6-26). Именно зту реакцию ингибируют пенициллин и его аналоги (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
