Osnovy_biokhimii_Nelson_i_Kokh_tom_1 (1123313), страница 95
Текст из файла (страница 95)
Результаты откладывают на графике в координатах 1/г „от 1/[6 [. На рис. 1 в двойных обратных координатах представлена серия экспериментальных данных, полученных без ингнбитора и с двухи разными концентрациями ннгибнтора. Полученные прямыс имеют общую точку пересечения на оси 1/ц„но разные углы наклона. Точка пересечения с осью 1/га соответствует 1/1' . „, из чего следует, что значение максимальной скорости нс зависит от присутствия конкурентного ннгибнтора.
Вне зависимости от когщснтрации конкурентного ннгибитора достаточно высокая концентрация субстрата будет вытеснять ингибитор нз активного цент]ж фермента. Над графиком привелено уравнение, полученное в результате преобразования уравнения 6-28, с помощью которого данный график был построен. Значение а можно рассчитать па основании угла наклона прямой при любом значении [Ц.
Зная а и [ Ц, можно ]хксчитагь К, по уравнению а = 1е [Ц / Кг В случае бескопкурентного и смешанного ингибировация графики в тех же координатах образуют семейства кривых, изображенные на рнс. 2 и 3. Изменение точек перессчепия с гюями говорит об изменении параметров У,. и Ккь Рис, 3. Смешанное ингибмрование. 6.3 Ферментативная кинетикэ как подход к пониманию механизма действия ферментов [297] пя = К'"'" 1"]т Ю (6-30) хм з.
„161 где 1Ч 1ЕоЛ41 о'=1+, н К1= К'1 [ЕЯ] тяя яябипярояяяяи Нет 10пп~у1х'нюпяй Кч,'и !я сконху1х и 1 ный Смапа~1ный 1'.,„, га' ойм а" ной скорости является признаком конкурентного ингибнрования и легко выявляется прн построении графика в лвойпых обратных координатах (доп. 6-2).
Константу равновесия для связывания ингибитора (К,) можно найти из того жс графика. Лечение людей, принявших внутрь метанол, основано на конкуренции за активный центр фермента печени алкогольдегидрогсназы. Этот фермент преобразует метанол в формальдсгид, поврежлаюший различные ткани организма. Обычным исходом попадания в организм метанола является слепота, поскольку глаза особенно чувствительны к формальдегиду. Этанол — альтернативный субстрат алкогольлегндрогеназьь Действие этанола напоминает действие конкурентного ингибитора, с тем отличием, что он также является субстратом, и его концентрация снижается по мере превращения в ацетальдегид.
Лечение при отравлении метанолом состоит в медленном впутривенном введении этанола с такой скоростью, которая позволяет поддерживать постоянной его концентрацию в крови на протяжении нескольких часов. В результате количество образующегося формальдегила уменыпается; в это время метанол фильтруется почками и выводится с мочой, не нанося вреда организму.
° Два других типа обратимого ингибнрования — бссконкурентнос и смешанное — часто описывают в терминах односубстратной ферментативной кинетики, по в реальности они встречаются только для ферментов, имсюпп1х несколько субстратов. Бескоикурентиый ингибитор (рис. 6-15, б) связывается вне активного центра фермента, и, в отличие от конкурентного ингибитора, только с комплексом ЕЯ. В присутствии бесконкурентного ингнбнтора уравнение Мнхаэлиса — Ментсн принимает следующий вил: и,=- "" - 6(6-29) ъ'„. „161 В соответствии с уравнением 6-29 при высоких концентрациях субстрата вп приближается к 1'„„/а'.
Таким образом, бесконкурентный ингибнтор снижает измеряемое значение Уя . Кажущаяся константа Михаэлиса также снижается, поскольку [5], требуемая для достижения /я У .„„, снижается в а' раз. Ингибитор, действующий по механизму смешанного типа (рнс. 6-15, п), также связывается вне активного центра, но как с Е, так и с ЕЯ. Уравнение скорости для случая смешанного ингибировапия имеет внл Смешанный тип нпгнбировапия обычно изменяет как Км, так и $'„, Особый случай ингибирования смешанного типа, возникающий прн а = а' н редко наблюдающийся на практике, называют неконкурентным ингибированием. Анализируя уравнение 6-30, можно понять, что нсконкурентньш ингибитор изменяет значение 1', „, но не влияет па Км.
Уравнение 6-30 в общем виде отражает влияние обратимых ингибиторов: его упрощения при а' = 1,0 илн а = 1,0 приволят соответственно к уравнениям для конкурентного н бссконкурентного ингибирования. На основании этого уравнения мы можем сделать общие выводы относительно влияния ннгибиторов на отдельные кинетические параметры. Для всех обратимых ннгибиторов кажущееся значение $~,„.. = 1'„я„/а', поскольку при достаточно высоких концентрациях субстрата правая сторона уравнения 6-30 всегда упрощается ло 1~,„я„/а'.
Для конкурентных ингибиторов а' = 1,0 и, следовательно, не принимается во внимание. Используя это выражение для К,м, можно получить общее выражение для кажущейся константы Михаэлиса и показать, как этот параметр изменяется в присутствии обратимых ингибиторов. Кажугцаяся константа Михаэлиса равна концентрации субстрата, прн которой ге = Х Ряя,м, иначе говоря, гп = 'г'яя /2а'.
Это условие выполняется при [5] = а Км/а. Таким образом, Км „= а Км/а'. Как видно из табл. 6-9, это выражение упрощается, если а или а' равны единице (т. с. для бссконкурентного или конкурентного нпгибитора). (298! Часть 1. 6. Ферменты На практике бссконкурснтное и смешанное ингибирование наблюдается только для ферментов с несколькими субстратами (скажем, 6< и Яз) и широко применяется для экспериментального изучения таких ферментов. Если ипгибитор связывается с центром, который обычно занят субстратом 1, то в экспериментах с изменением концентрации 6> он может вести себя как конкурентный ингибитор. Если ингибитор связывается с центром, который обычно занят субстратом 2, то он можст выступать в качестве бесконкурентного ингибитора или ингибитора смешанного типа по отношению к 6>. Наблюдаемый на практике характер ингибирования зависит от того, является связывание э< и эз упорядоченным или случайным; по экспериментальнымм данным можно судить о порядке присоединения субстратов и отделения пролуктов.
Часто дополнительную информацию можно получить, когда один из продуктов реакции выступает в качестве нпгибитора. Если в реакционной среле присутствует только один из двух продуктов реакции„то обратная рсакция происходить нс может. Однако продукт обычно связывается с участком активного центра и действует в качестве ингибитора. Для изучения механизма лвухсубстратпой ферментативной реакции используют кинстичсскис методы анализа с применением различных комбинаций продуктов и ингибиторов.
~ Пример 6-3 ВЛИЯНИЕ ИНГИБИТОРА НА КОНСТАНТУ ИИХАЗЛИСА Исследователи, изучавшие веселазу (см. примеры 6-1 и 6-2), выяснили, что сс мощным конкурентным ингибитором является вещество СТРЕСС. Добавленис 1 нМ СТРЕСС повышает измеряемое значение К„для субстрата ГРУСТЪ в два раза Определите значения а и а' в этих условиях. Решение. Вспомните, что кажущееся значение Км (значение Км, измеряемое в присутствии конкурентного ингибитора) соответствует а Км. Поскольку Км для ГРУСТЪ увеличивается вдвое в присутствии 1 нМ СТРЕСС, значение а должно быть равно двум.
Значение а' для конкурентного ингибитора по определению составляет единицу. НЕОБРАТИМОЕ ИНГИБИРОВАНИЕ. К необратимым интибиторам относятся те, которые образуют ковалентную связь с ферментом или выводят из строя сп> функциональные группы, необходимыс для катализа, а также тс, которые способны образовывать особенно устойчивые нсковалснтныс комплексы с ферментом. Образование ковалснтной связи между необратимым ингибитором и ферментом — это довслыю распространенное явление. Необратимые ингибиторы служат полезными инструментами для изучения механизмов реакции.
Если ингибнтор образует кона<ситную связь с определенными остатками фермента, в результате чего п1>оисходит его инактивация, то нлснтификация этих остатков помогает определить ключевые аминокислоты, задействованныс в катализе (рис. 6-16). Особым случаем необратимого ипгибирования является так называемое суицидное ингибирование. До тех пор, пока ингибитор такого рода не связался в активном центре фермента, оп обладает сравнительно низкой реакционной способностью. Суициднь<й ингибитор претерпевает нсскольк<> обычных стадий ферментативного превращен>и, но вместо того, чтобы превратиться в нормальный продукт, он превращается в соединение с очень высокой реакционной способностью, которое необратимо связывается с ферментом.
Подобные соединения иногда называют субстратоподобными ингибиторами, поскольку они инактивируют фермент, используя его собственный нормальный мсха- о сн, 1 / Ф р. "— СН,— ОН+ Р— Р— Π— СН <и ""> о сна с н,с н сн, ДФФ г +н' сн, Фгрмгк> — СН> — Π— Р— Π— СН ! о сн, 1 Рмс. 6-16. Нввбратммве мигмбмрованме. Взаимодействие химотрипсииа с дикзопропклфгорфосфатом (ДФФ) приводит к необратимому ингкбироаанкю фермента. На зтом основании бмл сделан вывод, что ключевым остатком серина в активном центре хкмотркпсина явллетсл Бег"'. 6.3 Ферментативная кинетиха ках подход к пониманию механизма действия ферментов [299[ пизм действия. Такие инп<биторы играют важную роль в современном подходе к <иа<рааяеннану поиску лекарственных гчмпаратое, в котором си<пез новых фармаколоп<чсских средств осу<цсствлястся на основа знания механизмов реакций. Правильно сконструированный суицидный ннгибитор специфичен лишь для одного фермента и нс вступает в реакцию, пока нс свяжется с активным центром фермента.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
