Osnovy_biokhimii_Nelson_i_Kokh_tom_1 (1123313), страница 91
Текст из файла (страница 91)
Коваленпппяй катализ. При ковалситпом ката- лизе между ферментом и субстратом временно образуется ковалептная связь. Рассмотрим реак- цию гидролиза связи между группами А и В: В присутствии ковалептного катализатора (фер- мента с нуклсофильной группой Х:) реакция при- обретает следующий вид: п,о А — В+ Х: — А — Х+  — А+ Х:+ В Таким образом, путь реакции меняется, и катализ осуществляется, только сели энергия активации нового пути ниже, чем энергия активации пекаталитической реакции.
Обе стадии попого процесса должны протекать быстрее, чем реакция без катализатора. В качестве нуклеофильиых групп, участвующих в образовании ковалептных связей с субстратом, могут выступать боковые цепи некоторых аминокислотных остатков, как те, что показаны на рис. 6-9, а также некоторые кофакторы. После образования ковалснтного комплекса обязательно происходит реакция, в результате которой высвобождается свободный фермент. Ковалептные связи между ферментом и субстратом могут специфическим образом активировать субстрат для последу>ощих реакций. Катализ ионами металлов.
Металлы, как прочно связанныс с ферментом, так и захватываемые из раствора вместе с субстратом, могут участвовать в катализе несколькими способами. Иоипыс 6.3 Ферментативная кинетика как подход к пониманию механизма действия ферментов ~ 285] йраткое содержание раэдела 6.2 КАК РАБОТАЮТ ФЕРМЕНТЫ взаимодействия мсжлу субстратом н связанным г ферментом металлом помогают ориентировать субстрат определенным образом или стабилизировать заряженную молекулу субстрата в персходном состоянии.
Такое использование слабых взаимодействий между металлом н субстратом напоминаетт некоторые типы испол ьзовапия энергии саязывания фермента с субстратом, описанные ранее. Кроме того, л»сталлы мокнут способствовать протеюшию окислительно-восстановительных реакций, обратимо изменяя свою степень окисления.
Около трети известных на ссголняпший день ферментов лля проявления каталитичсской активности нуждаются в присутствии одного нли нескольких ионов металлов. Большинство ферментов совмещают несколько стратегий катализа. Хорошим примером олновремснного использования ковалентпого„ об»пего кислотно-основного катализа и стабили- зацин в переходном состоянии может служить реакция, каталнзнруемая химотрипснпом, кото- рая более полробно рассматривается в разл. БА.
° Ферменты — зто исключительно активные катализаторы, ускоряющие реакции, как правило, н 1О' — 10'т раз. ° Ферментативные реакции характеризуются образованием фермент-субстратного комплекса (ЕЯ). Связывание субстрата происходит в полости молекулы фермента, называемой активным центром. ° Суть действия ферментов н других катализаторов заключается в снижении энергии активации (Л6"), в результате чего увеличивается скорость реакции.
Катализатор пе смещает ранновссия реакции. ° Значительная доля энергии, идущей на повышение скорости реакции, возникает за счет слабых взаимодействий (водородных, гнлрофобных, ионных) между ферментом и субстратом. Активный центр фермента устроен таким образом, что некоторые из этих слабых взаимодействий реачизуются только в переходном состоянии и стабилизируют его. Необходимость м»южества слабых связей является одной из причин, объясняющих большие размеры молекул ферментов.
Энергия связывания фермента с субстратом (ЛСв) ис»»ользуется лля снижения энтропии субстрата илн осуществления конформационных изменений в молекуле фермента (инлуциронанное соответствие). Энергия связывания, кроме того, вносит вклад в специфичность ферментов к их субстраталс ° К дополнительным каталнтнческнм механизмам с участием ферментов относятся общий кислотно-основной катазиз, ковалентный катализ и катализ ионами металлов.Ферменты часто образуют временныс ковалснтные связи с субстратами или осуществляют перенос определенных групп, в результате чего возникает новый путь реакции с более низкой энергией активации. о.З. Ферментативная кинетика как подход к пониманию механиэма действия ферментов Су»цествует несколько методов изучения механизмов действия ферментов.
Знание трехмерной структуры белка снабжает исследователей очень важной информацией, ценность которой еще»юлее возрастает при использовании подходов классической белковой химии и современных методов сайт-направленного мутагенеза (направленного изменения аминокнслотной последовательности белка генно-инженерным путем, рис.
9-11). Данные технологии позволяют биохимикам изучать роль отдельных аминокислот в структуре и функциях фермента. Однако основной подход к изучению механизма фсрментативной реакции заключается в определении скорости реакции н ее изменений в ответ на изменение внешних параметров, т. е. в изучении ферментативной кинетики реакций. Этот самый старый подход к исследованию механизмов ферментативных реакций остается наиболее важным. Мы остановимся на основных закономерностях ферментативпой кинетики. Цитируемые [286[ Часть й б. Ферменты в конце главы источники позволят более подробно изучить данный предмет.
Скорость ферментативной реакции зависит от концентрации субстрата Основным фактором, влияющим на скорость фсрментативной реакции, является концентрация субстрата [Я. Изучение влияния концентрации субстрата затрудняется тем, что зта концентрация меняется в холе реакции [п г1!тг по мере того, как субстрат превращается в продукт реакции. Один из подходов к решению данной проблемы в экспериментальной кинстикс заключается в определении начальной скорости процесса, обозначаемой га (рис.
6-10). В типичной реакции фермент присутствует в наномолярпой концентрации, тогда как концентрация субстрата на пять или шесть порядков вьппе. В начальный момент реакции (часто не болсс 60 с) концентрация субстрата изменяется нс более чем на несколько процентов, так что [э' [ считают постоянной величиной. В таком случае можно представить гр как функцию от Р. а с я3 О.
я л зс Время Рис. 6-10. Начальная скорость фермеитативных реакций. Гипотетический фермент катализирует реакцию Б = Р присутствуя в концентрации, достаточной для достижения максииальной скорости У - 1 М/иин. Константа Михазлиса К„(ее определение см. в тексте) составляет 0,5 икМ. На графике представлены кривые, соответствующие ходу реакции при концентрации субстрата, которая ниже значения Км равна или выше него. Скорость ферментативной реакции снижается па мере превращения субстрата в продукт.
Угол наклона касательной, проведенной к каждой кривой в момент времени г = О, соответствует начальной скорости у,. м а( О $ я О О О. м О 3 й Х Км Концентрация субстрата, [6[ (мМ) Рис. 6-11. Влияние концентрации субстрата иа начальную скорость фермеитативиой реакции. Максимальную скорость г' „можно определить из данного графика путем экстраполяции. поскольку она никогда не достигается. Концентрация субстрата, при которой уа соответствует половине максимальной скорости, назыааетса константой Михазлиса (Ки).
Концентрация фермента з экспериментах данного типа обычно настолько мала что соблюдается соотношение [Я)» [Е), даже если концеатрацию субстрата считают невысокой. Единицы измерения, приведенные на рисунке, являются типичными даа фериентативных реакций и представлены здесь для того, чтобы помочь читателю понять смысл параметров у, а Я.
Заиетьте, что данная кривая описывает лишь чпсжь гиперболы с одной асииптотой при У . Если продлить зту кривую ниже значения Я = О, она приблизится к вертикальной асииптоте при [Я = — Кя. концентраций субстрата, выбираемых самим исследователем. Влияние [61 на га при постоянной концентрации фермента продемонстрировано па рис. 6-11. При сравнительно низких концентрациях субстрата га растет почти линейно с ростом [Я. При более высоких значениях [Я[ рост г„замелляется. Наконец, достигается точка, после которой увеличение [Я приволит лишь к пренебрежимо малому увеличению значений га, т.
е. начальная скорость реакции приближается к максимальной скорости ( У,„). Для понимания подобного кинетического повеления системы необходимо учитывать образование фермент-субстратного коьшлекса Е5. На основании зависимости, представленной на рис. 6-11, в 1903 г. Виктор Анри, продолжавший раСюты Вюрца, предположил, что необходимой стадией фермснтативпой реакции является нзан- б.З Ферментатнвная хинетина хах подход х пониманию механизма действия ферментов [287] Леонор Михазпис, >879-2949 Мод Ментен, 1879-т9бо иолсйствис фермента с суГ>стратом, приводящее к образованию комплекса Е5. Эта идея была развита в обгцей теории ферментативного катализа, сформулироваш>ой в 1913 г. Леоиором Михаэлисом и Мод Ментен.
В данной теории постулируется, что сначала происходит быстрая обратимая реакция образования фермент-субстратного комплекса: в+5 = Еб (6-7) Затем комплекс Е5 с мсньшей скоростью распадается на свободный фертиент и пролукт реакции Р: ц Еб = Е+Р 4 2 (6-8) Поскольку более медленная вторая реакция лимитирует общую скорость процесса, общая скорость должна быть пропорциональна концентрации веществ, реагирующих на этой стадии, т. е.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
